半胱氨酰白三烯受體的基因轉(zhuǎn)染及半胱氨酰白三烯受體2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo).pdf

1、半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes,CysLTs,包括LTC4、LTD4和LTE4)是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)來源的一類重要炎癥介質(zhì),通過激活其受體(CysLT受體)參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種病理生理過程,如炎癥、支氣管哮喘、腦缺血再灌注損傷、創(chuàng)傷和休克等。CysLTs主要通過CysLT和CysLT2受體兩種受體以及新發(fā)現(xiàn)的GPR17起作用。
　　 鑒于目前研究開發(fā)的受體拮抗劑大部分是

2、CysLT1受體選擇性拮抗劑,缺乏CysLT2受體選擇性拮抗劑,所以,對CysLT1受體的功能研究較為深入,而對CysLT2受體的了解甚少。目前已克隆和鑒定兩種半胱氨酰白三烯受體(CysLT1和CysLT2受體),但GPR17的研究較少,因此,構(gòu)建GPR17真核表達(dá)質(zhì)粒,可為研究其功能奠定基礎(chǔ)。
　　 由于CysLT2受體與肺纖維化、動脈粥樣硬化、腦缺血等疾病密切相關(guān),因此,深入研究CysLT2受體功能特點(diǎn)非常必要。已有報道,C

3、ysLTs通過CysLT2受體可改變Egr-1和IL-8的表達(dá),但是,具體通過哪條通路?Egr-1作為轉(zhuǎn)錄因子,對IL-8是否有調(diào)節(jié)作用?這些都不是很清楚。需要研究CysLT2受體激活后是否通過ERK1/2、Egr-1途徑調(diào)節(jié)IL-8的分泌。
　　 第一部分大鼠GPR17基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能鑒定
　　 目的:構(gòu)建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-rGPR17,并對該受體功能

4、進(jìn)行初步研究。
　　 方法:從大鼠腦組織提取總RNA,通過RT-PCR擴(kuò)增rGPR17 cDNA,與載體pcDNA3.1(+)連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α以獲得重組載體pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、雙酶切和測序鑒定;將重組載體pcDNA3.1(+)-rGPR17通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,RT-PCR、免疫熒光法檢測rGPR17的表達(dá),Fluo-4測定激動劑LTD4處理后細(xì)胞內(nèi)鈣變化。
　

5、　 結(jié)果:RT-PCR、雙酶切和測序證明,重組的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-rGPR17構(gòu)建成功,并在HEK293細(xì)胞獲得表達(dá),加入外源性激動劑LTD4可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了rGPR17的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293細(xì)胞獲得功能性表達(dá)。
　　 第二部分 CysLT受體基因轉(zhuǎn)染及CysLT2受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　 目的:建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染半胱氨酰白三烯(

6、CysLT)受體的HEK293細(xì)胞,并在此基礎(chǔ)上研究hCysLT2受體激活后的信號通路。
　　 方法:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將pcDNA3.1-hCysLT1、pcDNA3.1-hCysLT2、pcDNA3.1-rGPR17轉(zhuǎn)到HEK293細(xì)胞中,并用600μg/ml G418篩選得到陽性單克隆細(xì)胞株。用雙熒光素酶報告基因檢測IL-8激活程度。同時用RT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫組織化學(xué)法等方法檢測Egr-1的表

7、達(dá),用RT-PCR和ELISA檢測IL-8的表達(dá)和分泌,Western blot方法檢測信號通路分子的激活。
　　 結(jié)果:雙熒光素酶報告基因檢測表明,HEK293轉(zhuǎn)染hCysLT2的細(xì)胞,與轉(zhuǎn)染hCysLT1和rGPR17這兩種細(xì)胞比較,LTD4能明顯夠激活I(lǐng)L-8,且LTC4的作用強(qiáng)于LTD4。在hCysLT2-HEK293細(xì)胞中,LTC4能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Egr-1、IL-8的表達(dá)增加,刺激IL-8的分泌。ERK1/2抑制劑(U

8、0126)可以抑制Egr-1、IL-8的表達(dá);對Egr-1進(jìn)行干擾抑制細(xì)胞內(nèi)Egr-1,可抑制IL-8的表達(dá)及分泌。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)hCysLT1、hCysLT2和rGPR17受體的HEK293細(xì)胞株;在hCysLT2-HEK293細(xì)胞,白三烯(LTD4、LTC4)可通過ERK1/2-Egr-1通路引起IL-8的分泌。
　　 總結(jié)
　　 1.成功構(gòu)建了rGPR17的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)