半胱氨酰白三烯受體在小鼠腦和肺組織生理及病理過程的表達.pdf

1、半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括LTC4，LTD4，LTE4)是花生四烯酸5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)的代謝產(chǎn)物。CysLTs是很強的炎癥介質(zhì)，參與多種炎癥反應(yīng)過程，如介導(dǎo)呼吸道平滑肌痙攣、微血管滲漏等病理反應(yīng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，半胱氨酰白三烯參與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，如腦缺血、腦外傷、腦出血、腦腫瘤、腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、癲癇以及衰老等。在腦外傷、腦腫瘤、腦缺血等

2、病理狀態(tài)下，腦內(nèi)CysLTs產(chǎn)生增加，并參與血腦屏障破壞、腦水腫的發(fā)生。 CysLTs通過其受體發(fā)揮生理作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和克隆了兩種半胱氨酰白三烯受體(cysteinylleukotrienesreceptors)，即CysLT1和CysLT2受體，它們均為經(jīng)典的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體。CysLT1受體有多種拮抗劑，如zafirlukast、montelukast、tomelukast、pobilukast、pranluka

3、st(ONO-1078)和MK-571，它們均能拮抗CysLTs引起的人支氣管收縮。目前，已有部分拮抗劑在臨床用于支氣管哮喘的治療。但是，CysLT2受體只有非選擇性拮抗劑Bayu9773、FPL55712。 CysLT1受體分布在脾臟、肺、胎盤、小腸、表皮和支氣管平滑肌等組織，以及單核淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞和纖維原細(xì)胞等細(xì)胞。CysLT2受體則存在于肺、脾臟、

4、心臟、淋巴結(jié)、小腸、表皮、腎、腦和前列腺等組織，以及單核淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟浦肯野細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、氣管平滑肌細(xì)胞、人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞、冠狀動脈平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞。 雖然CysLT1和CysLT2受體表達的研究很多，但是其生理及病理意義尚未完全闡明，尤其在以下方面。其一，在發(fā)育過程中腦和肺組織的CysLT1和CysLT2受體表達特征，還未見報道。其二，CysLTs可以增加血腦屏障的通

5、透性、導(dǎo)致腦水腫；5-脂氧酶抑制劑、CysLT1受體拮抗劑對腦缺血有保護作用。然而，在腦缺血等腦損傷時，CysLT1和CysLT2受體在腦的表達和分布的變化不清楚。其三，CysLTs引起呼吸道平滑肌收縮，血管滲出增加，氣管水腫，黏液分泌增多，并且，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞募集，參與氣道的炎癥反應(yīng)。這些均與CysLT1和/或CysLT2受體有關(guān)聯(lián)。雖然CysLTs作用在哮喘中有比較多的研究，但是，CysLT1和CysLT2受體在哮喘引起的炎癥氣道

6、時的表達，以及CysLT1拮抗劑對受體表達的調(diào)節(jié)還不清楚。 因此，為了了解CysLT1和CysLT2受體在肺和腦組織不同的生理和病理狀態(tài)下的表達狀況，本實驗觀察了三個方面的內(nèi)容。一是小鼠發(fā)育過程中腦和肺組織CysLT1和CysLT2受體的表達特點；二是小鼠持續(xù)性局灶性腦缺血急性期CysLT1和CysLT2受體在腦內(nèi)的表達，與急性神經(jīng)元損傷的關(guān)系，以及CysLT1受體腦內(nèi)分布特點和介導(dǎo)神經(jīng)損傷的作用；三是小鼠慢性哮喘模型中，肺內(nèi)炎

7、癥變化以及與CysLT1和CysLT2受體表達的關(guān)系，CysLT1受體拮抗劑對CysLT1和CysLT2受體表達的調(diào)節(jié)作用。 本論文通過探討CysLT1和CysLT2受體在發(fā)育過程、腦缺血和哮喘中的表達，在分子水平探索CysLT1和CysLT2受體表達特征，為明確CysLT1和CysLT2受體在個體發(fā)育的生理過程以及腦缺血和哮喘等病理過程中的作用，提供理論基礎(chǔ)。 第一部分半胱氨酰白三烯受體在小鼠腦和肺組織不同發(fā)育時期的表

8、達 目的：研究小鼠在不同發(fā)育時期腦和肺組織CysLT1和CysLT2受體mRNA的表達變化。方法：應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法，檢測小鼠胚胎末、出生1天、3天、7天、10天、30天、成年(60天)和老年(2年)時期CysLT1和CysLT2受體mRNA的表達。結(jié)果：在腦組織，CysLT1受體mRNA在小鼠出生前后1天表達較高；出生第3天開始下降，第7天降到低谷，并持續(xù)到第10天；出生后30天，表達顯著升高，并持續(xù)到成年鼠；但到了

9、老年鼠，表達又降到了低谷。而CysLT2受體mRNA在腦的發(fā)育時期表達，從小鼠出生前后1天開始逐步下降；但出生第10天出現(xiàn)表達高峰；老年期表達降到低谷。在肺組織，CysLT1受體mRNA在胚胎末期表達較低；出生后1周內(nèi)維持在較高水平；10天時表達降低；表達高峰在出生后30天；以后逐步降低，在老年鼠出現(xiàn)第二個低谷。CysLT2受體mRNA表達高峰在出生10天，老年鼠出現(xiàn)低谷。結(jié)論：小鼠腦和肺組織CysLT1和CysLT2受體mRNA表達，

10、在出生后1周至1個月期間變化較大；而老年鼠腦和肺組織CysLT1和CysLT2受體mRNA的表達都處于低谷。 第二部分半胱氨酰白三烯受體在小鼠腦缺血時的表達 目的：確定CysLT1和CysLT2受體是否參與小鼠局灶性腦缺血后急性神經(jīng)元損傷。方法：以大腦中動脈阻塞法誘導(dǎo)小鼠局持續(xù)性灶性腦缺血，測定缺血后48h內(nèi)不同時間的神經(jīng)缺損癥狀、不同腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)量；應(yīng)用RT-PCR法測定缺血后不同時間腦內(nèi)CysLT1和CysLT2受體

11、mRNA表達；以免疫組化雙標(biāo)方法確定CysLT1受體在神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布；并且，用CysLT1受體選擇性拮抗劑pranlukast來驗證CysLT1受體在急性缺血性神經(jīng)損傷的作用。結(jié)果：小鼠在持續(xù)性局灶性腦缺血后6、24、48h發(fā)生神經(jīng)功能缺損，爬板試驗的滯留角減小，皮層、海馬CA1區(qū)及紋狀體神經(jīng)元數(shù)量減少。腦組織CysLT1和CysLT2受體mRNA的表達，隨著缺血時間的延長而升高；其中CysLT1受體mRNA在缺血后1、3、

12、24和48h顯著增高；CysLT2受體mRNA在缺血后1、24和48h顯著增高；它們的表達峰值均在缺血后24h。CysLT1受體選擇性表達在缺血24h后腦半球的皮層、海馬CA1區(qū)及紋狀體神經(jīng)元。結(jié)論：CysLT1和CysLT2受體均參與小鼠局灶性腦缺血后急性神經(jīng)元損傷；CysLT1受體蛋白選擇性分布在缺血區(qū)神經(jīng)元。 第三部分半胱氨酰白三烯受體在小鼠哮喘肺內(nèi)表達及受體拮抗劑的調(diào)節(jié)作用 目的：檢測卵白蛋白(OVA)誘導(dǎo)的哮喘

13、小鼠氣道嗜酸細(xì)胞炎癥時半胱氨酰白三烯受體(CysLT1與CysLT2受體)的表達變化，以及CysLT1受體拮抗劑孟魯司特的調(diào)節(jié)作用。方法：在OVA慢性致敏誘導(dǎo)C57BL/6小鼠哮喘模型，計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織切片嗜酸性粒細(xì)胞，測定BALF中白介素-5(IL-5)含量，以半定量RT-PCR檢測肺組織CysLT1和CysLT2受體的mRNA表達。結(jié)果：OVA攻擊誘導(dǎo)致敏小鼠發(fā)生哮喘變化后，CysLT1受體mRNA表達增高(

14、32.4％)，但CysLT2受體mRNA表達降低(68.0％)；同時發(fā)生肺內(nèi)及BALF中嗜酸性粒細(xì)胞增加，BALF中IL-5增高。孟魯司特(6mg/kg，1天1次，共20天)顯著減少哮喘小鼠肺組織切片及BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，抑制IL-5增高。孟魯司特還抑制CysLT1受體mRNA表達升高(70.9％)，但不改變CysLT2受體mRNA表達下降。結(jié)論：CysLT受體受免疫反應(yīng)調(diào)控，孟魯司特能抑制哮喘小鼠嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和CysLT1

15、受體表達上調(diào)。 結(jié)論1.小鼠腦和肺組織CysLT1和CysLT2受體mRNA表達，在出生后1周至1個月期間變化較大；而老年鼠腦和肺組織CysLT1和CysLT2受體mRNA的表達都處于低谷。 2.CysLT1和CysLT2受體參與局灶性腦缺血后急性神經(jīng)元的損傷；CysLT1受體選擇性分布于缺血側(cè)神經(jīng)元，并參與神經(jīng)元損傷的調(diào)節(jié)。 3.CysLT1受體在哮喘肺內(nèi)表達增加，CysLT2受體表達降低；CysLT1受體拮抗