2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩114頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、糖尿?。╠iabetes mellitus,DM)是目前危害人類特別是老年人健康的主要疾病之一,已成為導致全球人口死亡的第四大疾病。目前全球糖尿病患者已超過2.5億人,在20年內就可能增至3.8億人。全球每10秒鐘就有2人被診斷為糖尿病,1人死于糖尿病相關性疾病。它是一種慢性非傳染性疾病,由體內胰島素缺乏或耐受所致。糖尿病可分為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病等,其中Ⅰ型糖尿病的病因是在遺傳易感基因的基礎上在外界環(huán)境因素的作用下,引發(fā)機體自身免疫功能紊

2、亂,導致胰島β細胞的損傷和破壞,最終使胰島素分泌絕對不足。 目前臨床上治療糖尿病的主要方法是藥物治療和飲食療法,雖然可以在一定程度上控制癥狀和避免并發(fā)癥的發(fā)生,但只能治標,不能治本,于是胰島細胞移植便成了治療糖尿病最有希望的治本方法。供體胰島細胞不足和免疫排斥限制了這種治療方法的應用。近年來,隨著干細胞理論和干細胞技術的發(fā)展,利用干細胞定向誘導分化和干細胞移植技術治療糖尿病的研究成了糖尿病治療研究中的一大熱點。 干細胞(

3、stem cell)是一類具有自我復制和多向分化潛能的的早期未分化細胞,在適宜的條件下或給予適宜的信號,可以分化為不同類型的具有特征性形態(tài)、特異分子標志和特殊功能的成熟細胞。根據(jù)干細胞分化潛力的不同,干細胞可以分為全能干細胞(totipotential stem cell)、多能干細胞(multipotential stem cell)和單能干細胞(unipotential stem cell),單能干細胞又稱為組織特異性干細胞(tis

4、sue-specific stem cell)或成體干細胞(adult stem cell,ASC)。成體干細胞存在于多種組織和器官中,具有自我復制能力,并能夠分化為所在組織的細胞,補充失去生理功能的細胞或修復損傷,以維持組織內環(huán)境的穩(wěn)定?,F(xiàn)已明確,不僅胚胎干細胞可以縱向分化為不同組織的前體細胞,進而發(fā)育成相應組織的功能細胞,成體干細胞在特定的條件下也可以橫向分化為其它組織細胞。由于成體干細胞取材相對容易,來源豐富,可實現(xiàn)個體化治療、避

5、免了免疫排斥反應及無倫理道德等問題而具有廣闊的應用前景。 已有的研究發(fā)現(xiàn)胰腺導管上皮細胞、肝卵圓細胞等都有成體干細胞的特性。但因上述細胞來源和自我更新增殖能力有限,誘導分化得到的胰島素分泌細胞量少,難以成為細胞治療的種子細胞。骨髓中含有造血干細胞(hematopoictic stem cell)和問充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)。研究發(fā)現(xiàn),BMSCs

6、在體內外不同的微環(huán)境中可以被誘導分化為多種細胞類型。由于BMSCs具有易于分離培養(yǎng)和體外擴增,并可自體移植無免疫排斥反應的特點,因此利用BMSCs的橫向分化潛能,可以根據(jù)需要將其誘導分化為特定的組織細胞,用以修復受損的組織或器官。 體內可供胰島素分泌細胞(insulin-producing cells,IPCs)移植的部位很多,實驗中采取的大多數(shù)移植部位還沒有應用于臨床。以往肝臟被認為是最合適的移植部位。然而,研究者們越來越認識

7、到肝臟的生理和解剖特性可以促使移植細胞的死亡;另外,手術方法也限制了足量的移植細胞進入肝門靜脈循環(huán)。Bendayan和Park報道了十二指腸隱窩和肌層間的結締組織中存在典型的胰島結構。他們還發(fā)現(xiàn),鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病大鼠的十二指腸壁中的胰島主要包含胰高血糖素細胞,胰島素分泌細胞已消失。研究發(fā)現(xiàn),小腸黏膜下層能產(chǎn)生各種有利于細胞的生長因子,例如成纖維細胞生長因子-2(fibroblast grow

8、th factor-2)、轉化生長因子(transforming growth factor)、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor)等。近來的研究也證實了體外培養(yǎng)于小腸黏膜下層的人胰島可以保持較高的功能。體內的實驗研究也表明,移植到黏膜下層的胰島也可以保持較高的功能。 基于上述理念,我們設計了該項研究,目的是為了探討干細胞自體移植治療糖尿病的可行性,為此類疾病的治療提供一條

9、新途徑。本研究由三部分組成,即骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)和誘導分化;大鼠糖尿病動物模型的建立;胰島素分泌細胞十二指腸壁內自體移植治療糖尿病。論文發(fā)表于“The AnatomicalRecord”。 第一部分骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)和誘導分化 骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)和體外擴增是進行干細胞誘導分化研究的前提。骨髓間充質干細胞在骨髓中的含量很少,106個骨髓單個核細胞中僅含有2~5個BMSCs,因此要獲得足量細胞用于后續(xù)

10、的誘導分化和自體移植實驗,大量擴增純化是十分必要的。本實驗根據(jù)BMSCs密度比較低和容易貼壁生長的特點,采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結合的方法。首先用淋巴細胞分離液經(jīng)過梯度離心去除大部分的造血細胞,再通過貼壁培養(yǎng)、換液去除懸浮生長的造血細胞,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)擴增。結果顯示,經(jīng)密度梯度離心獲得的細胞,原代培養(yǎng)4d時即可形成由BMSCs組成的細胞集落;約7~8d時,集落內細胞密集,細胞分裂相減少;用0.25%胰蛋白酶-0

11、.02%EDTA消化細胞,含血清培養(yǎng)基中止消化,進行傳代培養(yǎng),傳代細胞增殖較快,約5d可傳一代,傳至3代時經(jīng)流式細胞術證實得到較純的BMSCs。在成功分離培養(yǎng)BMSCs的基礎了上,我們進行了干細胞體外定向誘導分化為胰島素分泌細胞的研究。經(jīng)過多次實驗,我們成功地摸索出了一個BMSCs誘導分化為胰島素分泌細胞的最佳方案:取生長良好的第3代骨髓間充質干細胞,按2×105/ml密度接種于6孔板中,每孔加2ml含10ng/ml堿性成纖維細胞生長因

12、子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、10ng/ml表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和2%的B27的L-DMEM培養(yǎng)基;培養(yǎng)6天后,去除舊培養(yǎng)液,用D-Hank's液沖洗3遍,然后將細胞培養(yǎng)于含10ng/ml肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、10ng/mlβ細胞調節(jié)素(β-cellulin)、10ng/ml活化素A(a

13、ctivinA)、10mmol/L尼克酰胺和2%B27的H-DMEM培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)6天。誘導6天時細胞形態(tài)略有變化,多呈圓形,少數(shù)細胞呈多角形或長梭型,折光性明顯增強,開始出現(xiàn)小的細胞簇;第12天時多數(shù)細胞已聚集成簇,結構類似胰島。RT-PCR結果顯示,分化細胞能表達胰島β細胞分化和內分泌功能相關基因。進一步的Western blot和胰島素免疫細胞化學染色結果表明,分化的細胞能合成和表達胰島素。這一部分實驗的結果說明,我們所設計的

14、復合誘導劑可誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為功能性胰島β細胞,從而為進一步的細胞自體移植治療糖尿病提供了細胞來源。 第二部分大鼠糖尿病動物模型的建立 建立一穩(wěn)定可重復的糖尿病動物模型是進行細胞移植治療實驗研究的基本條件。我們選用大鼠為實驗動物,用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法,選擇性的破壞胰島β細胞,成功地建立了該病的動物模型。給藥后,大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿、體重下降。大鼠空腹血糖測試結果顯示,注射后3d模型組血糖明顯升高

15、,超過16.7mmol/L,與給藥前血糖相比有顯著性差異(P<0.01),而對照組給藥前后血糖無顯著性差異(P>0.05)。給藥后1周、2周、3周、4周血糖檢測結果顯示,模型組大鼠血糖逐漸升高,始終保持在16.7mmol/L以上;而對照組大鼠血糖水平保持正常,兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。大鼠體重檢測結果表明,給藥后,模型組大鼠的體重持續(xù)下降;而對照組大鼠的體重保持增加,兩組相比有顯著性差異(P<0.05)。給藥后2周和4周處死

16、模型鼠取胰腺,進行石蠟切片,常規(guī)HE染色和胰島素免疫組化染色,光鏡觀察顯示,胰島素陽性表達的β細胞明顯減少,HE染色可見胰腺外分泌細胞無異常,未發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤;在對照組中可觀察到胰島素陽性表達的胰島β細胞無異常表現(xiàn)。該動物模型的成功建立,為干細胞移植治療該病的實驗研究提供了前提條件。 第三部分胰島素分泌細胞十二指腸壁內自體移植治療糖尿病 在成功建立動物模型的基礎上,我們從模型鼠的股骨和脛骨中取骨髓間充質干細胞,定向誘導

17、分化12天后,自體移植到供體鼠的十二指腸壁內,并設手術對照組。細胞移植1周后,血糖檢測結果顯示,胰島素分泌細胞移植治療組大鼠血糖恢復正常,而對照組大鼠血糖仍維持高值,兩組間有顯著性差異(P<0.01);腹膜腔內糖耐量實驗表明,細胞移植治療組大鼠血糖反應曲線與正常對照組相近。移植后2、4和8周,組織學檢測結果顯示,移植細胞存活良好,主要存在于腸壁的黏膜下層,少部分分布于粘膜層;隨著移植時間延長,細胞逐漸聚集形成細胞簇,胰島素免疫組織化學染

18、色呈陽性。這說明移植細胞能夠在十二指腸壁內存活,并能分泌胰島素,受體動物可恢復正常血糖水平。 結論: 本項研究通過建立糖尿病的大鼠實驗模型,成功地分離培養(yǎng)、體外擴增和鑒定了骨髓間充質干細胞,優(yōu)化了體外誘導分化為胰島素分泌細胞的條件,成功地將誘導分化后的胰島素分泌細胞進行糖尿病大鼠十二指腸壁內自體移植并進行了多項移植后檢測,結果顯示:移植細胞在腸壁內存活,并呈現(xiàn)胰島素免疫組化陽性著色,糖尿病癥狀明顯改善,說明對糖尿病有明顯

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論