BMSCs向胰島素細胞定向誘導(dǎo)分化及腸壁內(nèi)自體移植治療糖尿病的實驗研究.pdf

1、糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是目前危害人類特別是老年人健康的主要疾病之一，已成為導(dǎo)致全球人口死亡的第四大疾病。目前全球糖尿病患者已超過2．5億人，在20年內(nèi)就可能增至3．8億人。全球每10秒鐘就有2人被診斷為糖尿病，1人死于糖尿病相關(guān)性疾病。它是一種慢性非傳染性疾病，由體內(nèi)胰島素缺乏或耐受所致。糖尿病可分為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病等，其中Ⅰ型糖尿病的病因是在遺傳易感基因的基礎(chǔ)上在外界環(huán)境因素的作用下，引發(fā)機體自身免疫功能紊

2、亂，導(dǎo)致胰島β細胞的損傷和破壞，最終使胰島素分泌絕對不足。 目前臨床上治療糖尿病的主要方法是藥物治療和飲食療法，雖然可以在一定程度上控制癥狀和避免并發(fā)癥的發(fā)生，但只能治標，不能治本，于是胰島細胞移植便成了治療糖尿病最有希望的治本方法。供體胰島細胞不足和免疫排斥限制了這種治療方法的應(yīng)用。近年來，隨著干細胞理論和干細胞技術(shù)的發(fā)展，利用干細胞定向誘導(dǎo)分化和干細胞移植技術(shù)治療糖尿病的研究成了糖尿病治療研究中的一大熱點。 干細胞（

3、stem cell）是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的的早期未分化細胞，在適宜的條件下或給予適宜的信號，可以分化為不同類型的具有特征性形態(tài)、特異分子標志和特殊功能的成熟細胞。根據(jù)干細胞分化潛力的不同，干細胞可以分為全能干細胞（totipotential stem cell）、多能干細胞（multipotential stem cell）和單能干細胞（unipotential stem cell），單能干細胞又稱為組織特異性干細胞（tis

4、sue-specific stem cell）或成體干細胞（adult stem cell，ASC）。成體干細胞存在于多種組織和器官中，具有自我復(fù)制能力，并能夠分化為所在組織的細胞，補充失去生理功能的細胞或修復(fù)損傷，以維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。現(xiàn)已明確，不僅胚胎干細胞可以縱向分化為不同組織的前體細胞，進而發(fā)育成相應(yīng)組織的功能細胞，成體干細胞在特定的條件下也可以橫向分化為其它組織細胞。由于成體干細胞取材相對容易，來源豐富，可實現(xiàn)個體化治療、避

5、免了免疫排斥反應(yīng)及無倫理道德等問題而具有廣闊的應(yīng)用前景。 已有的研究發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管上皮細胞、肝卵圓細胞等都有成體干細胞的特性。但因上述細胞來源和自我更新增殖能力有限，誘導(dǎo)分化得到的胰島素分泌細胞量少，難以成為細胞治療的種子細胞。骨髓中含有造血干細胞（hematopoictic stem cell）和問充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs

6、在體內(nèi)外不同的微環(huán)境中可以被誘導(dǎo)分化為多種細胞類型。由于BMSCs具有易于分離培養(yǎng)和體外擴增，并可自體移植無免疫排斥反應(yīng)的特點，因此利用BMSCs的橫向分化潛能，可以根據(jù)需要將其誘導(dǎo)分化為特定的組織細胞，用以修復(fù)受損的組織或器官。 體內(nèi)可供胰島素分泌細胞（insulin-producing cells，IPCs）移植的部位很多，實驗中采取的大多數(shù)移植部位還沒有應(yīng)用于臨床。以往肝臟被認為是最合適的移植部位。然而，研究者們越來越認識

7、到肝臟的生理和解剖特性可以促使移植細胞的死亡；另外，手術(shù)方法也限制了足量的移植細胞進入肝門靜脈循環(huán)。Bendayan和Park報道了十二指腸隱窩和肌層間的結(jié)締組織中存在典型的胰島結(jié)構(gòu)。他們還發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的十二指腸壁中的胰島主要包含胰高血糖素細胞，胰島素分泌細胞已消失。研究發(fā)現(xiàn)，小腸黏膜下層能產(chǎn)生各種有利于細胞的生長因子，例如成纖維細胞生長因子-2（fibroblast grow

8、th factor-2）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor）等。近來的研究也證實了體外培養(yǎng)于小腸黏膜下層的人胰島可以保持較高的功能。體內(nèi)的實驗研究也表明，移植到黏膜下層的胰島也可以保持較高的功能。 基于上述理念，我們設(shè)計了該項研究，目的是為了探討干細胞自體移植治療糖尿病的可行性，為此類疾病的治療提供一條

9、新途徑。本研究由三部分組成，即骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化；大鼠糖尿病動物模型的建立；胰島素分泌細胞十二指腸壁內(nèi)自體移植治療糖尿病。論文發(fā)表于“The AnatomicalRecord”。 第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和體外擴增是進行干細胞誘導(dǎo)分化研究的前提。骨髓間充質(zhì)干細胞在骨髓中的含量很少，106個骨髓單個核細胞中僅含有2～5個BMSCs，因此要獲得足量細胞用于后續(xù)

10、的誘導(dǎo)分化和自體移植實驗，大量擴增純化是十分必要的。本實驗根據(jù)BMSCs密度比較低和容易貼壁生長的特點，采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法。首先用淋巴細胞分離液經(jīng)過梯度離心去除大部分的造血細胞，再通過貼壁培養(yǎng)、換液去除懸浮生長的造血細胞，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)擴增。結(jié)果顯示，經(jīng)密度梯度離心獲得的細胞，原代培養(yǎng)4d時即可形成由BMSCs組成的細胞集落；約7～8d時，集落內(nèi)細胞密集，細胞分裂相減少；用0．25％胰蛋白酶-0

11、．02％EDTA消化細胞，含血清培養(yǎng)基中止消化，進行傳代培養(yǎng)，傳代細胞增殖較快，約5d可傳一代，傳至3代時經(jīng)流式細胞術(shù)證實得到較純的BMSCs。在成功分離培養(yǎng)BMSCs的基礎(chǔ)了上，我們進行了干細胞體外定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細胞的研究。經(jīng)過多次實驗，我們成功地摸索出了一個BMSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細胞的最佳方案：取生長良好的第3代骨髓間充質(zhì)干細胞，按2×105/ml密度接種于6孔板中，每孔加2ml含10ng/ml堿性成纖維細胞生長因

12、子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、10ng/ml表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和2％的B27的L-DMEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)6天后，去除舊培養(yǎng)液，用D-Hank's液沖洗3遍，然后將細胞培養(yǎng)于含10ng/ml肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、10ng/mlβ細胞調(diào)節(jié)素（β-cellulin）、10ng/ml活化素A（a

13、ctivinA）、10mmol/L尼克酰胺和2％B27的H-DMEM培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)6天。誘導(dǎo)6天時細胞形態(tài)略有變化，多呈圓形，少數(shù)細胞呈多角形或長梭型，折光性明顯增強，開始出現(xiàn)小的細胞簇；第12天時多數(shù)細胞已聚集成簇，結(jié)構(gòu)類似胰島。RT-PCR結(jié)果顯示，分化細胞能表達胰島β細胞分化和內(nèi)分泌功能相關(guān)基因。進一步的Western blot和胰島素免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果表明，分化的細胞能合成和表達胰島素。這一部分實驗的結(jié)果說明，我們所設(shè)計的

14、復(fù)合誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為功能性胰島β細胞，從而為進一步的細胞自體移植治療糖尿病提供了細胞來源。 第二部分大鼠糖尿病動物模型的建立 建立一穩(wěn)定可重復(fù)的糖尿病動物模型是進行細胞移植治療實驗研究的基本條件。我們選用大鼠為實驗動物，用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法，選擇性的破壞胰島β細胞，成功地建立了該病的動物模型。給藥后，大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿、體重下降。大鼠空腹血糖測試結(jié)果顯示，注射后3d模型組血糖明顯升高

15、，超過16．7mmol/L，與給藥前血糖相比有顯著性差異（P<0．01），而對照組給藥前后血糖無顯著性差異（P>0．05）。給藥后1周、2周、3周、4周血糖檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠血糖逐漸升高，始終保持在16．7mmol/L以上；而對照組大鼠血糖水平保持正常，兩組相比有顯著性差異（P<0．01）。大鼠體重檢測結(jié)果表明，給藥后，模型組大鼠的體重持續(xù)下降；而對照組大鼠的體重保持增加，兩組相比有顯著性差異（P<0．05）。給藥后2周和4周處死

16、模型鼠取胰腺，進行石蠟切片，常規(guī)HE染色和胰島素免疫組化染色，光鏡觀察顯示，胰島素陽性表達的β細胞明顯減少，HE染色可見胰腺外分泌細胞無異常，未發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤；在對照組中可觀察到胰島素陽性表達的胰島β細胞無異常表現(xiàn)。該動物模型的成功建立，為干細胞移植治療該病的實驗研究提供了前提條件。 第三部分胰島素分泌細胞十二指腸壁內(nèi)自體移植治療糖尿病 在成功建立動物模型的基礎(chǔ)上，我們從模型鼠的股骨和脛骨中取骨髓間充質(zhì)干細胞，定向誘導(dǎo)

17、分化12天后，自體移植到供體鼠的十二指腸壁內(nèi)，并設(shè)手術(shù)對照組。細胞移植1周后，血糖檢測結(jié)果顯示，胰島素分泌細胞移植治療組大鼠血糖恢復(fù)正常，而對照組大鼠血糖仍維持高值，兩組間有顯著性差異（P<0．01）；腹膜腔內(nèi)糖耐量實驗表明，細胞移植治療組大鼠血糖反應(yīng)曲線與正常對照組相近。移植后2、4和8周，組織學(xué)檢測結(jié)果顯示，移植細胞存活良好，主要存在于腸壁的黏膜下層，少部分分布于粘膜層；隨著移植時間延長，細胞逐漸聚集形成細胞簇，胰島素免疫組織化學(xué)染

18、色呈陽性。這說明移植細胞能夠在十二指腸壁內(nèi)存活，并能分泌胰島素，受體動物可恢復(fù)正常血糖水平。 結(jié)論: 本項研究通過建立糖尿病的大鼠實驗?zāi)Ｐ?，成功地分離培養(yǎng)、體外擴增和鑒定了骨髓間充質(zhì)干細胞，優(yōu)化了體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細胞的條件，成功地將誘導(dǎo)分化后的胰島素分泌細胞進行糖尿病大鼠十二指腸壁內(nèi)自體移植并進行了多項移植后檢測，結(jié)果顯示：移植細胞在腸壁內(nèi)存活，并呈現(xiàn)胰島素免疫組化陽性著色，糖尿病癥狀明顯改善，說明對糖尿病有明顯