G-CSF在野百合堿誘導(dǎo)的肝小靜脈閉塞病中的治療作用及其機(jī)制探討.pdf

1、肝小靜脈閉塞病(HVOD)是特殊藥物性肝損的嚴(yán)重類型。因其發(fā)病機(jī)制未完全明了，目前治療方法有限、效果欠佳，本研究將在建立動物疾病模型的基礎(chǔ)上，探討多效應(yīng)因子G-CSF對HVOD的可能治療作用及其機(jī)制。 第一部分： 目的： 建立、評價、必要時修改Delcve等提出的野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的大鼠HVOD模型以便進(jìn)一步研究。 方法： 將42只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為5組(A為

2、正常對照組，B、C為MCT 160mg/kg組，D、E為MCTl00mg/l(g組)，實驗第0天采用一次性灌胃法給予MCT或磷酸鹽緩沖液PBS，A、B和D組于造模第7天處理大鼠(C、E組在第10天)，測定并比較各組大鼠的腹水量、肝/體重、白細(xì)胞計數(shù)WBC、中性粒細(xì)胞百分比Neu％、血小板計數(shù)、總膽紅素TBil、轉(zhuǎn)氨酶ALI及AST等指標(biāo)，評估該模型和人類HVOD的相似性；對肝組織行HE、Masson染色后，分別采用Deleve等的光鏡評

3、分系統(tǒng)和修改后的評分系統(tǒng)(添加肝竇纖維化和肝細(xì)胞凝固性壞死兩項，取消早、晚期HVOD的區(qū)分)對病理切片進(jìn)行評分來判斷病變的嚴(yán)重程度；并對肝組織行PCNA免疫組化染色。 結(jié)果： 1.組B-D大鼠都有腹水、肝/體重和TBil升高等表現(xiàn)，其中B、C組各有1只在實驗第6天死亡，尸檢均為重度HVOD；和組A相比，組B出現(xiàn)了WBC、Neu％、ALT、AST的升高及血小板的降低(P<0.05)；和B組相比，C組的腹水量、TBil、Ne

4、u％、ALT和AST均有一定下降，但仍高于組A(P<0.05)；E組和D組相比，肝/體重、TBil、腹水、Neu％、ALT和AST均有下降(P<0.05)，其中TBil、腹水、Neu％已和A組無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)。2.修改后的病理評分提示B組均屬重度；C組中8只屬重度，1只為中度；而D組5只屬中度，2只為輕度；E組2只屬中度，余為輕度。 2.組A大鼠的肝細(xì)胞也有一定的PCNA陽性率(18.9±6.1％)，MCT作用后其值有增加(

5、P<0.05)；而內(nèi)皮細(xì)胞的PCNA陽性率在組A中很低(2.0±0.8％)，MCT作用后有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 小結(jié)： 1.MCT能劑量依賴性地誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生HVOD，該模型能較好體現(xiàn)人類HVOD的臨床和組織學(xué)特征:MCT劑量小時模型的自愈傾向較明顯，劑量大時能構(gòu)造較穩(wěn)定的重度HVOD： 2.該HVOD模型的肝組織中存在肝竇纖維化和肝細(xì)胞凝固性壞死，故修改后的光鏡評分系統(tǒng)能更好反映組織學(xué)的變化：

6、 3.該模型的自愈傾向可能和受損后肝內(nèi)PCNA陽性細(xì)胞百分比的升高有關(guān)。 第二部分： 目的：探討不同劑量的G-CSF對大鼠HVOD的可能治療作用和療效。 方法：將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(A為正常對照組，B-D為MCT 160mg/kg，采用一次灌胃法造模)，灌胃后第3天始予以皮下注射G-CSF 10 μg/kg(治療組C)、100μg/kg(治療組D)或等量生理鹽水NS(模型組B)，每天1次，共7

7、天，于實驗第10天處理大鼠，測定各組大鼠的腹水量、肝/體重、WBC、Neu％、血小板計數(shù)、TBil、ALT和AST等指標(biāo)；采用修改后的方法對組織切片進(jìn)行病理學(xué)評分，了解病變嚴(yán)重程度；免疫組化染色后計算肝組織PCNA陽性細(xì)胞百分比，用ELISA法測定血漿中腫瘤壞死因子TNF-α、凝血酶原激活物抑制因子PAI-1的含量。 結(jié)果： 1.和對照組A相比，治療組C、D仍表現(xiàn)為肝/體重、TBil增加和腹水，但和模型組B相比，其值均有

8、下降(P<0.05)；在實驗室指標(biāo)上，D組WBC、Neu％有所升高，C組變化不明顯，而C、D組轉(zhuǎn)氨酶均下降至接近正常水平，且兩組間無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)；在細(xì)胞因子的檢測中發(fā)現(xiàn)，組A中TNF-α和PAI-1的含量均較低，在組B中其值明顯升高，經(jīng)G-CSF處理后下降(P<0.05)，但在治療組C和D之間無統(tǒng)計學(xué)差異。 2.和模型組B相比，治療組的光鏡下評分有明顯下降(P<0.05)，但C、D組之間無統(tǒng)計學(xué)差別。 3.

9、模型組B肝組織中PCNA陽性細(xì)胞百分比較對照組A有所升高(尤其是肝細(xì)胞，P(0.05)，而G-CSF治療后HVOD大鼠肝細(xì)胞和SEC的PCNA陽性百分比明顯升高，但C、D組之間無統(tǒng)計學(xué)差別。 小結(jié)： 1.常規(guī)劑量和小劑量的G-CSF對HVOD均有一定的治療作用，能減輕患鼠的臨床癥狀、改善其實驗室指標(biāo)，從而延緩病情的進(jìn)展，但應(yīng)用常規(guī)劑量時應(yīng)注意其伴隨的血白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)增加； 2.血PAI-1可作為該模型中病情

10、和療效的監(jiān)測指標(biāo)； 3.G-CSF處理可使肝PCNA陽性細(xì)胞百分比升高、血TNF-α值降低，其作用機(jī)制可能和G-CSF具有促進(jìn)細(xì)胞再生、抑制TNF-α的分泌有關(guān)。 第三部分： 目的：通過檢測和比較各組大鼠肝組織中G-CSFR、STAT3等基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)來探討G-CSF緩解HVOD的可能分子機(jī)制。 方法； 將各組大鼠(組A-PBS+NS、B組-MCT 160mg/kg+NS、C組-MCT

11、160mg/kg+G-CSF10 ug/kg、D組-MCT160 mg/kg+G-CSF 100 ug/kg)的肝組織，包括4％甲醛固定的和在-80℃冰箱內(nèi)凍存的，用免疫組化、RT-PCR和Westernblot等方法檢測G-CSFR、STAT3和p-STAT3的表達(dá)，并用ANOVA等統(tǒng)計方法進(jìn)行各組間的比較。 結(jié)果： 各組大鼠的肝組織中均有G-CSFR、STAT3和p-STAT3表達(dá)；從相對表達(dá)量上看，模型組B稍有增加