白藜蘆醇對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺動脈高壓是臨床致死率很高的疾病，其發(fā)病率逐年升高，目前尚無能夠有效改善患者生存狀態(tài)的治療手段;近年來，中藥單體在防治心肺血管疾病方面取得了顯著成效，白藜蘆醇是其中較為突出的，有望改善肺動脈高壓患者生存狀態(tài)。
　　目的:
　　1.觀察腹腔注射野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)大鼠模型的穩(wěn)定性，并探討其機(jī)制;
　　2.觀測白藜蘆醇(resveratrol，RE

2、S)對PAH大鼠血流動力學(xué)、肺組織外觀及血管病理發(fā)展的影響，驗(yàn)證RES對PAH的治療作用;
　　3.檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和cGMP依賴性蛋白激酶的表達(dá)水平，初步探討RES防治PAH的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.動物分組及造模:SPF級成年雄性SD大鼠34只，購入后普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成2組:正常對照組(Ct)10只，模型組24只;模型組腹腔注射野百合堿(monocrota

3、line，MCT)，造模成后再隨機(jī)平分為MCT模型組(M)和白藜蘆醇治療組(RES);于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行生存率分析。
　　2.測定血流動力學(xué)指標(biāo)及右心室肥厚指數(shù):各實(shí)驗(yàn)組大鼠于第8周處理，記錄體重，經(jīng)胸經(jīng)右室測平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)，取出心臟，分離右心室，稱濕重并計算右心室肥厚指數(shù)。
　　3.組織病理檢測:大鼠左肺下葉做石蠟切片，行免疫組化檢測、HE及 Masson

4、染色，以觀察肺組織病理改變;采用Image Pro Plus軟件測量分析小微動脈的管腔和平均直徑，計算肺動脈肥厚指數(shù)。右肺門組織做電鏡切片，透射電鏡下觀察肺動脈管壁組織超微結(jié)構(gòu)。
　　4.氧化應(yīng)激檢測:利用試劑盒檢測大鼠肺組織抗氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione peroxidase，GSH)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和氧化應(yīng)激因子丙二醛(

5、Malondialdehyde，MDA)的活性。
　　5.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和cGMP依賴性蛋白激酶（guanosine3'，5'-cyclic phosphate-dependent protein kinase1，PKG-1）檢測:取右肺中葉放入凍存管，后期將組織制成勻漿并提取蛋白，采用westernblot檢測iNOS和PKG-1的表達(dá)水平;免疫組化

6、檢測iNOS和PKG-1的表達(dá)及位點(diǎn)。
　　6.統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)均以（均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.采用腹腔注射MCT后4周成功復(fù)制出大鼠PAH模型，造模期大鼠死亡率為12.5％(4/24)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)三組死亡率分別為:Ct:0％，M:40％(4/10)，RES:10％(1/10);
　　2.Ct、M、R

7、ES平均肺動脈壓力分別為(8.78±0.64vs20.88±1.53vs11.22±0.57/mmHg， P＜0.01Ct vs.M， P＜0.05 RES vs.M)，右室肥厚指數(shù)(24.70±1.08vs57.69±4.46vs31.672±1.33/％, P＜0.01Ct vs.M,P＜0.05 RES vs.M)，肺動脈肥厚指數(shù)(71.00vs95.33vs77.75(％)，P＜0.001Ct vs.M，P＜0.01 RES v

8、s.M)，模型組與正常組和治療組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　3.PAH大鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示小、微動脈中層肥厚，管腔狹窄甚至閉塞，周圍組織炎癥浸潤明顯，肺動脈管壁和管腔周圍組織嚴(yán)重纖維化;RES組肺組織炎癥浸潤及纖維化程度均較M組輕微;
　　4.透射電鏡觀察可見M組肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變形，向管腔突出，部分脫落，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，基底膜和周圍增生的纖維組織分布紊亂，界限模糊，RES組平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常;<

9、br>　　5.免疫組化及western blot結(jié)果顯示，iNOS主要表達(dá)在炎癥細(xì)胞及炎癥浸潤區(qū)域，在RES組的表達(dá)明顯低于M組，Ct組iNOS極少表達(dá);PKG-1在RES組表達(dá)與Ct組接近，均顯著高于M組，廣泛分布在血管及肺泡細(xì)胞內(nèi)，指標(biāo)量化分析結(jié)果顯示M組與RES和Ct組比較，iNOS和PKG-1表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Ct vs.M，P＜0.001，RES vs.M，P＜0.01)。
　　6.氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH、C

10、AT、MDA的活性Ct、M、RES分別為:SOD:(340.09±7.39) vs.(166.19±5.14vs.(219.49±3.11), GSH(1.14±0.04) vs.(0.51±0.02) vs.(0.77±0.03), CAT(38.80±1.06) vs.(25.91±1.03) vs.(34.26±0.98), MDA:(0.83±0.02) vs.(1.39±0.04) vs.(0.96±0.02))，組間比較差異

11、均有統(tǒng)計學(xué)意義(Ct vs.M,P＜0.01, RES vs.M,P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.腹腔注射野百合堿建立肺動脈高壓大鼠模型成功率高，穩(wěn)定性好，其形成機(jī)制與組織炎癥浸潤、氧化應(yīng)激、iNOS高表達(dá)及PKG-1表達(dá)抑制有關(guān);
　　2.白藜蘆醇對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺組織病理損傷具有明確的治療作用;
　　3.白藜蘆醇防治肺動脈高壓可能機(jī)制是通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，降低iNOS的表達(dá)，增加P