VEGF對(duì)人肝癌細(xì)胞體外形成血管生成擬態(tài)能力的影響.pdf

1、研究目的:
　　通過(guò)外源加入不同濃度VEGF-A(vascular endothelial growth factor A)和內(nèi)源轉(zhuǎn)染VEGF-A質(zhì)粒兩個(gè)方面研究VEGF對(duì)人肝癌PLC細(xì)胞遷移、侵襲及體外形成血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)能力的影響。
　　方法:
　　1.選取人肝癌細(xì)胞系PLC，37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為：正常對(duì)照組和加入不同濃度(10μg/L、30μ

2、g/L、60μg/L、100μg/L)VEGF-A組;
　　2.利用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察加入不同濃度VEGF-A誘導(dǎo)人肝癌PLC細(xì)胞后，細(xì)胞遷移能力的變化；
　　3.利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察加入不同濃度VEGF-A誘導(dǎo)人肝癌PLC細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲能力的變化；
　　4.明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬

3、蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)活性的變化；
　　5.三維培養(yǎng)觀察加入不同濃度VEGF-A后各組肝癌細(xì)胞體外形成三維管道能力的變化；
　　6.Western blot檢測(cè)加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細(xì)胞內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)表達(dá)的變化；
　　7.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse trans

4、cription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細(xì)胞VE-cadherin mRNA表達(dá)水平的變化；
　　8.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VEGF質(zhì)粒進(jìn)入人肝癌PLC細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果；
　　9.劃痕實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細(xì)胞遷移能力的變化；
　　10.Transwell實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細(xì)胞侵襲能力的變化；<

5、br>　　11.明膠酶譜實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9表達(dá)活性的變化；
　　12.三維培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細(xì)胞體外形成三維管道能力的變化；
　　13.Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細(xì)胞VE-cadherin表達(dá)的變化；
　　14.RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細(xì)胞VE-cadherin mRNA表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:<

6、br>　　1.遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細(xì)胞向劃痕中央遷移的距離明顯大于正常對(duì)照組(P<0.05)，并呈劑量依賴性；
　　2.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A組的PLC細(xì)胞穿膜數(shù)明顯多于正常對(duì)照組(P<0.05)；
　　3.明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9表達(dá)活性增強(qiáng)(P<0.05)，并呈劑量依賴性；

7、r>　　4.三維培養(yǎng)結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細(xì)胞形成管道能力明顯增強(qiáng)，VEGF-A的濃度與管道數(shù)量之間呈顯著正相關(guān)(r=0.929)；
　　5.Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細(xì)胞的VE-cadherin表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05)；
　　6.Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染VEGF質(zhì)粒后的人肝癌PLC細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；<

8、br>　　7.轉(zhuǎn)染VEGF后，肝癌PLC細(xì)胞向劃痕中央遷移的距離明顯大于正常對(duì)照組(P<0.05)：
　　8.Transwell結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGF組的PLC細(xì)胞穿膜數(shù)明顯多于正常對(duì)照組(P<0.05)：
　　9.轉(zhuǎn)染VEGF質(zhì)粒后，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌PLC細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性增強(qiáng)(P<0.05)；
　　10.三維培養(yǎng)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VEGF后，肝癌PLC細(xì)胞能形成明顯的三維管道，而未轉(zhuǎn)染

9、組沒(méi)有管道形成；
　　11.Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VEGF后PLC細(xì)胞VE-cadherin的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　VEGF能增強(qiáng)人肝癌PLC細(xì)胞的遷移、侵襲能力和VM形成能力，VEGF是肝癌VM形成中的重要調(diào)控分子，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)MMPs和VE-cadherin促進(jìn)肝癌VM的形成，使腫瘤組織形成多樣化的局部微循環(huán)，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)為肝癌的抗血管治療