攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡行對比超聲評價腎缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 靶向分子顯像研究是目前國際上影像學(xué)技術(shù)領(lǐng)域正在探討的前沿?zé)狳c(diǎn)，經(jīng)典的靶向分子顯像技術(shù)主要有核素影像及核磁共振成像(MRI)技術(shù)。然而，具有空間和時間分辨率高、適應(yīng)面廣、價格便宜、可重復(fù)使用和無放射污染等優(yōu)點(diǎn)超聲影像在靶向分子顯像研究上卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它影像學(xué)技術(shù)。近年來，隨著靶向超聲微泡造影劑的出現(xiàn)，靶向超聲分子顯像(targeted ultrasoundmolecular imaging)逐漸成為現(xiàn)實(shí)，極大的

2、拓展了傳統(tǒng)超聲微泡的應(yīng)用范圍，使應(yīng)用超聲技術(shù)從分子水平對各種疾病進(jìn)行早期診斷成為可能，被譽(yù)為超聲醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的“第三次革命”，具有極大的研究和應(yīng)用價值，勢必會在分子影像學(xué)中發(fā)揮非常重要的作用。
　　 血管內(nèi)皮損傷/炎癥普遍存在于冠心病、高血壓和糖尿病等危害人類健康和生命的重要疾病之中，與它們的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。血管內(nèi)皮損傷/炎癥時，血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素表達(dá)明顯上調(diào)，介導(dǎo)血小板和中性粒細(xì)胞的募集、外滲，后者被激活并釋放大

3、量前炎癥介質(zhì)和趨化因子，在加重?fù)p傷和炎癥反應(yīng)方面起重要作用。因此，如能成功構(gòu)建外殼攜帶有抗P-選擇素單抗的靶向超聲微泡，并行對比超聲檢查獲得“P-選擇素”的靶向超聲分子圖像，則可望無創(chuàng)性的早期評價組織和器官的血管內(nèi)皮損傷/炎癥，這無疑將具有十分重要的臨床意義。
　　 近幾年，運(yùn)用靶向超聲分子顯像技術(shù)評價微血管炎癥或相關(guān)的血管內(nèi)皮反應(yīng)已日益成為國內(nèi)外超聲領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的臨床意義。但目前相關(guān)研究在國際上尚處

4、于試驗(yàn)研究的起步階段，存在諸多問題亟待解決；而國內(nèi)尚未見有應(yīng)用高效價靶向微泡評價微血管炎癥或相關(guān)的血管內(nèi)皮反應(yīng)的報(bào)道，相關(guān)研究基本還沒有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。
　　 腎臟作為機(jī)體的主要高灌注器官之一，對缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)十分敏感。腎缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是臨床上頗為多見的重要病理生理現(xiàn)象，常見于低血容量性休克、腎臟移植等情況。有研究表明，I

5、RI是缺血性腎功能衰竭的主要損傷環(huán)節(jié)，也是腎移植手術(shù)后影響移植腎早期功能恢復(fù)及遠(yuǎn)期存活時間的重要因素。腎IR時，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-選擇素增加，促進(jìn)血小板和中性粒細(xì)胞沿血管內(nèi)皮滾動、黏附、聚集和外滲，后者可介導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)并釋放多種炎癥介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、血栓素A2(TXA2)等，進(jìn)而導(dǎo)致腎微血管及細(xì)胞損傷，是造成腎IRI的重要原因。目前，臨床上尚無有效評價腎IRI血管內(nèi)

6、皮損傷/炎癥的無創(chuàng)性檢測手段，若能構(gòu)建針對腎IRI時血管內(nèi)皮炎癥相關(guān)因子(P-選擇素)的靶向超聲微泡，并行對比超聲實(shí)現(xiàn)靶向超聲分子顯影對腎IRI作出早期的有效評價或診斷，無疑對臨床早期防治IRI具有積極意義。
　　 因此，本研究在普通脂質(zhì)微泡的基礎(chǔ)上，通過“抗生物素蛋白/生物素復(fù)合體”(avidin-biotin)的化學(xué)橋接作用(bridging chemistry)將抗小鼠P-選擇素單克隆抗體連接于脂質(zhì)微泡外殼構(gòu)建了攜帶抗P-

7、選擇素單抗靶向微泡(MBp)，并在腎缺血再灌注損傷及腎假手術(shù)小鼠模型上，應(yīng)用MBp和普通脂質(zhì)微泡(無攜帶抗P-選擇素單抗的脂質(zhì)微泡，MB)行對比超聲檢查，目的在于探討MBp結(jié)合CEU評價小鼠腎缺血再灌注血管內(nèi)皮損傷的可行性。
　　 材料和方法：
　　 1、超聲微泡的制備：各種脂質(zhì)材料按一定比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中，同時通全氟丙烷(C3F8)氣體，超聲振蕩至形成乳白色液體制備普通脂質(zhì)微泡(MB)或生物素(Bioti

8、n)化脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合脂質(zhì)純化4次后，按一定比例加入抗生蛋白鏈菌素/親和素(streptavidin)。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗生蛋白鏈菌素純化微泡2次后得到外殼結(jié)合有抗生蛋白鏈菌素的脂質(zhì)微泡，再按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-選擇素單抗(biotin conjugated ratanti-mouse P-selectin monoclone antibody)得到

9、攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡(MBp)，最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗體純化MBp2次。MB及MBp均于冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。采用庫爾特?jì)數(shù)儀測量MB及MBp的平均粒徑及濃度。
　　 2、MBp的體外鑒定：采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗P-選擇素單抗結(jié)合，熒光顯微鏡下觀察抗P-選擇素單抗與微泡的連接情況。采用平行板流動腔技術(shù)在體外模擬的生理血流條件下評價MBp與小鼠P-選擇素Fc段(RecombinantMouse P-

10、Selectin/Fc Chimera，PSFc)的靶向黏附效能。3、動物模型的制備：16只小鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組(SH組，6只)及腎缺血再灌注組(IR組，10只)。所有實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)常規(guī)麻醉后，尾靜脈插留置針用于注射微泡，背部備皮后隨機(jī)取一側(cè)行約1.2cm縱行切口，游離腎臟，IR組小鼠行無損傷動脈夾夾閉腎蒂，造成腎缺血達(dá)30min后釋放動脈夾再灌注1h；SH組小鼠只作一側(cè)腎臟游離，不作腎蒂夾閉。
　　 4、腎CEU檢查及圖像分

11、析：對所有實(shí)驗(yàn)小鼠行MB和MBp的腎對比超聲檢查。動物模型制備后，將處理腎回納小鼠體內(nèi)并置自制水囊于小鼠腎臟之上，用自制支架固定超聲探頭(17L5)于水囊上，調(diào)整探頭位置獲得良好腎臟圖像后保持探頭位置在整個實(shí)驗(yàn)過程中不變，儀器的各項(xiàng)參數(shù)在整個實(shí)驗(yàn)過程中保持不變。CEU采用經(jīng)尾靜脈微泡彈丸式注射法進(jìn)行，每只實(shí)驗(yàn)小鼠采用微量進(jìn)樣器經(jīng)尾靜脈隨機(jī)(間隔30min)注射MB和MBp的數(shù)量均為約4×106個。經(jīng)過10min循環(huán)時間待血池中循環(huán)微泡消

12、失后對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行腎CEU檢查，獲取實(shí)驗(yàn)小鼠缺血再灌注腎和假手術(shù)腎的顯影圖像。CEU檢查采用二次諧波成像(second hamonic imaging)技術(shù)進(jìn)行，探頭發(fā)射和接收頻率分別為7.0和14MHz，機(jī)械指數(shù)(Mechanical Index，MI)為0.18，超聲發(fā)射間隔(PulsingInterval，PI)時間設(shè)定為10s，獲取第一幀CEU圖像(代表MB及MBp在腎組織中的滯留濃度)后給予高M(jìn)I(1.9)連續(xù)超聲發(fā)射2～3s

13、以破壞微泡，繼續(xù)存儲本底圖像4～5幀，全部聲學(xué)造影圖像存于MO盤，以備脫機(jī)分析。采用MCE軟件分析CEU圖像，測量實(shí)驗(yàn)小鼠缺血再灌注腎和假手術(shù)腎超聲顯影的聲強(qiáng)度(video intensity,Ⅵ)數(shù)值并制作彩色編碼圖。
　　 5、病理學(xué)檢查和免疫組化檢查：完成CEU圖像采集后，取出實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟，10％甲醛固定，行病理學(xué)檢查及免疫組化檢查。
　　 結(jié)果：
　　 1、微泡制備情況：采用庫爾特計(jì)數(shù)儀測得MB平均粒徑為

14、2.83um，濃度約為1.5×109個/毫升；MBp平均粒徑2.73um，濃度約為7.1×108個/毫升。
　　 2、MBp體外鑒定情況：采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗P-選擇素單抗結(jié)合，熒光顯微鏡下觀察顯示MBp外殼顯明顯綠色熒光，表明抗P-選擇素單抗與微泡外殼連接效果良好。平行板流動腔體外評價結(jié)果顯示，在模擬微血管生理血流條件的剪切應(yīng)力(＜1.0dyn/cm2)下MBp可與包被于平行板流動腔的PSFc有效結(jié)合，顯示了很好的主動性

15、靶向黏附效能。
　　 3、腎CEU檢查結(jié)果：MBp的第一幀CEU圖像顯示IR組缺血再灌注腎可見顯著的超聲顯影，而SH組假手術(shù)腎無明顯的超聲顯影；MB的第一幀CEU圖像在IR組缺血再灌注腎可見輕度的超聲顯影，其顯影強(qiáng)度較MBp的IR組缺血再灌注腎明顯減弱，而MB的第一幀CEU圖像在SH組假手術(shù)腎中無明顯的超聲顯影。
　　 4、CEU圖像分析結(jié)果：Ⅵ值在SH組-MBp及SH組-MB分別為2.93±1.33和2.73±1.29

16、，兩者之間無明顯差異(P=0.797)。與SH組相比，IR組-MBp和IR組-MB的Ⅵ值呈顯著和輕度的增大(P=0.000)，分別為30.99±9.83和9.87±3.68。IR組-MBp的Ⅵ值是SH組-MBp的10.58倍，而IR組-MB的Ⅵ值僅是SH組-MB的3.62倍。IR組-MB的Ⅵ平均值僅為IR組-MBp的31.8％(P=0.001)。
　　 5、腎組織病理學(xué)檢查及免疫組化檢查結(jié)果：HE切片結(jié)果顯示，SH組假手術(shù)腎組織

17、腎小管排列整齊，形態(tài)正常，間質(zhì)無充血、水腫；IR組缺血再灌注腎組織可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性，內(nèi)可見管型和壞死脫落細(xì)胞，伴腎間質(zhì)水腫及中性粒細(xì)胞增多；免疫組化結(jié)果顯示，IR組缺血再灌注腎組織血管內(nèi)皮P-選擇素表達(dá)明顯增加，而SH組假手術(shù)腎組織血管內(nèi)皮無明顯的P-選擇素表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡(MBp)行CEU檢查產(chǎn)生“主動性靶向超聲分子顯像”可有效評價小鼠腎缺血再灌注損傷，將可用