P-選擇素靶向超聲分子成像評(píng)價(jià)心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、背景和目的： 心肌缺血再灌注損傷（IRI）常見于急性冠脈綜合癥、心絞痛患者，是冠脈介入術(shù)后常見的病理生理現(xiàn)象，也是導(dǎo)致心力衰竭的主要損傷環(huán)節(jié)。而相關(guān)研究表明，38％的發(fā)生急性心肌缺血事件的患者常常會(huì)由于傳統(tǒng)臨床檢測(cè)手段如心電圖、早期血清心肌酶標(biāo)記物等檢查結(jié)果不具診斷性導(dǎo)致診斷延遲，甚至漏診。超聲心動(dòng)圖的室壁運(yùn)動(dòng)分析和對(duì)比超聲灌注成像雖然能夠提供一些額外的信息來指導(dǎo)臨床治療，但其對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的檢測(cè)提供的指導(dǎo)信息有限。因此

2、，如果能夠發(fā)展一種技術(shù)檢測(cè)手段，在心肌缺血事件發(fā)生之后仍能夠依靠對(duì)“缺血記憶”成像對(duì)曾發(fā)生缺血事件的心肌部位和范圍做出評(píng)價(jià)，這無疑具有重大臨床意義。 材料和方法： 1．超聲微泡的制備：各種相關(guān)脂質(zhì)材料按一定質(zhì)量比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中，同時(shí)通全氟丙烷（C3F8）氣體，超聲振蕩至形成乳白色液體制備普通脂質(zhì)微泡或生物素（biotin）化脂質(zhì)微泡（MB）。MB經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合脂質(zhì)純化1次后，按一

3、定比例加入抗生蛋白鏈菌素（streptavidin）。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗生蛋白鏈菌素純化微泡1次后，按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-選擇素單克隆抗體（biotin conjugated rat anti-mouse P-selectin monoclone antibody）和同型對(duì)照抗體（isotype control antibody），分別得到攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡（MBp）和同型對(duì)照微泡（MBc

4、），最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗體純化微泡1次，冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。采用庫爾特?jì)數(shù)儀測(cè)量超聲微泡的平均粒徑及濃度。 2．?dāng)y熒光FITC超聲微泡的制備：MB經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合脂質(zhì)純化1次后，按一定比例加入FITC-抗生蛋白鏈菌素（streptavidin），得到攜熒光FITC的MB。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合FITC-抗生蛋白鏈菌素抗生蛋白鏈菌素純化微泡1次后，按一定比例加入生

5、物素化的抗小鼠P-選擇素單克隆抗體，得到攜帶熒光FITC的MBp，最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗體純化微泡1次，冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?3．超聲微泡體外評(píng)價(jià)：采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗P-選擇素單抗結(jié)合熒光顯微鏡下觀察抗P-選擇素單抗與微泡的連接情況。 4．超聲微泡體內(nèi)評(píng)價(jià)：應(yīng)用攜熒光FITC的超聲微泡和熒光顯微鏡相結(jié)合，直視下觀察超聲微泡在小鼠提睪肌微循環(huán)中的行為特征，并對(duì)超聲微泡粘附途徑/效能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

6、 5．動(dòng)物模型的制備和分組： 5．1．提睪肌炎癥模型的制備：20只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組和TNF-α（tumor necrosis factor-α）處理組。構(gòu)建小鼠的提睪肌炎癥模型后，再根據(jù)隨機(jī)注射超聲微泡的不同，分為MBp組和MB組。所有小鼠采用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后，將小鼠仰臥位固定四肢于自制平臺(tái)的透明墊上，尾靜脈插管用于微泡的注入。TNF-α處理組以TNF-α50ug稀釋到0．3ml

7、的鹽水中，陰囊注入。2小時(shí)后分離出提睪肌，并將其最大程度的平鋪在自制平臺(tái)的透明墊上，然后將透明墊鼠板放置于熒光顯微鏡上。實(shí)驗(yàn)過程中用恒溫平衡克氏液持續(xù)緩慢滴在提睪肌上。 5．2．心肌缺血再灌注模型的制備：10只實(shí)驗(yàn)小鼠常規(guī)麻醉后，尾靜脈插留置針用于注射微泡。經(jīng)胸骨左側(cè)第四肋間開口，鈍性分離皮下肌肉，暴露心臟，結(jié)扎左前降支血管。實(shí)驗(yàn)過程中心電圖實(shí)時(shí)監(jiān)視，以心電圖ST段抬高≥0．1mv作為模型成功標(biāo)志。結(jié)扎10min后，去除塑料管，

8、撤掉結(jié)扎線。以ST段恢復(fù)正常作為再灌注模型成功標(biāo)志。10只心肌缺血再灌注小鼠先后隨機(jī)注入MBp和MBc后行MCE檢查，并根據(jù)注入超聲微泡的不同分為MBp組和MBc組。 6．超聲微泡粘附性能評(píng)價(jià)：小鼠提睪肌炎癥模型建立后，尾靜脈注入5×106個(gè)MBp或MB，用適于觀察熒光標(biāo)記脂質(zhì)微泡（470-490nm）的熒光過濾器和高分辨率制冷相機(jī)記錄5min內(nèi)20高倍鏡視野下MBp或MB在微循環(huán)（主要是20-40μm的小靜脈）中的粘附數(shù)量和粘

9、附途徑；采集熒光標(biāo)記脂質(zhì)微泡熒光和常光下在血管內(nèi)的粘附圖像，存于個(gè)人計(jì)算機(jī)，并對(duì)不同粘附途徑的微泡數(shù)量進(jìn)行分類匯總。 7．心肌MCE檢查及圖像分析：動(dòng)物模型制備后，用支架固定超聲探頭（17L5）于小鼠心腔上方，調(diào)整探頭位置獲得良好的左室短軸切面顯像后保持探頭位置在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不變，儀器的各項(xiàng)參數(shù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不變。灌注成像和MCE檢查均采用相干脈沖序列成像技術(shù)（Coherent Pulse Sequence，CPS）成像方式

10、實(shí)時(shí)觀察，探頭發(fā)射頻率為7．0MHZ，機(jī)械指數(shù)（MI）為0．2。灌注成像：結(jié)扎小鼠冠脈后，靜脈注入5×105個(gè)MB，評(píng)價(jià)心肌灌注缺損區(qū)域。靶向超聲成像：每只小鼠采用微量進(jìn)樣器經(jīng)尾靜脈隨機(jī)（間隔30min）先后注射MBc和MBp的數(shù)量約為1×106個(gè)。在注入微泡5min后行MCE，獲取第一幀圖像后給予高M(jìn)I的連續(xù)超聲發(fā)射2-3s以破壞微泡，繼續(xù)存儲(chǔ)本底圖像2-3幀，全部聲學(xué)造影圖像存于CD盤，以備脫機(jī)分析。第一幀圖像聲強(qiáng)度（Ⅵ，視頻密度）

11、可代表靶向微泡在組織中的總濃度，包括粘附和循環(huán)微泡。微泡破壞后存儲(chǔ)圖像上的Ⅵ反應(yīng)的是在血池中循環(huán)微泡的濃度。前者減去后者得到的是粘附微泡在組織中的濃度。取圖結(jié)束后，應(yīng)用MCE圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)量小鼠心臟造影的Ⅵ值，并用彩色編碼技術(shù)制作心臟顯影的彩色編碼圖像，采用紅色、橙色和白色依次代表心肌顯影的強(qiáng)度由弱到強(qiáng)。 8．統(tǒng)計(jì)分析：使用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。實(shí)驗(yàn)一統(tǒng)計(jì)分析，采用o

12、ne-way ANOVA分析，方差不齊則選用近似F檢驗(yàn)Welch法。組間多重比較方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnet T3檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)二組間比較采用二階段交叉設(shè)計(jì)方差分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)T檢驗(yàn)。α=0．05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。 9．病理學(xué)及免疫組化檢查：圖像采集完成后，取出小鼠心臟，10％甲醛固定，行病理學(xué)檢查及免疫組化檢查。 結(jié)果： 1．超聲微泡制備情況：采用庫爾特技術(shù)儀測(cè)得庫爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得MBp濃

13、度為1．06×109個(gè)/ml，微泡平均粒徑為2．30±1．06μm；MBc濃度為1．03×109個(gè)/ml，微泡平均粒徑為2．07±1．13μm。 2．超聲微泡體外評(píng)價(jià)結(jié)果：采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗P-選擇素單抗結(jié)合，熒光顯微鏡下觀察顯示MBp外殼顯明顯綠色熒光，表明抗P-選擇素單抗與微泡外殼連接良好。 3．超聲微泡體內(nèi)評(píng)價(jià)結(jié)果：攜熒光FITC的MB通過白細(xì)胞的介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)和血管內(nèi)皮的非特異性靶向，而MBp則可直接與血管內(nèi)皮

14、結(jié)合實(shí)現(xiàn)特異性靶向，顯示了特異的粘附性能。TNF-α處理組MBp粘附數(shù)量多達(dá)12．0±2．6個(gè)/視野，MB僅為3．0±1．2個(gè)/視野，兩者相比具有顯著差異（P=0．002）；而對(duì)照組MBp和MB粘附數(shù)量分別為1．4±0．6個(gè)/視野和2．4±1．1個(gè)/視野，兩者之間未見顯著差異（P=0．472）。TNF-α處理組MBp粘附數(shù)量與對(duì)照組MBp和MB粘附數(shù)量相比差異顯著（P=0．002），并分別為對(duì)照組MBp和MB粘附數(shù)量的6．4±1．7倍和

15、9．9±2．1倍。 4．MCE檢查結(jié)果：MBp組的第一幀MCE圖像顯示缺血區(qū)域可見顯著造影增強(qiáng)，而非缺血區(qū)域無明顯超聲顯影；MB組第一幀MCE圖像缺血區(qū)域只見輕度造影增強(qiáng)，其顯影強(qiáng)度較MBp組缺血區(qū)域明顯減弱，非缺血區(qū)域未見明顯超聲顯影。 5．對(duì)比超聲Ⅵ分析：Ⅵ值在MBp組和MBc組非缺血區(qū)均未見顯著增大，分別為6．53±0．95和6．41±0．78，兩者之間無顯著性差異（P=0．522）；而在缺血區(qū)MBp組（25．98

16、±6．23）較MBc組（9．12±0．91）顯著增大，兩者之間差異具有顯著性（P=0．000）。MBp組缺血區(qū)Ⅵ值為非缺血區(qū)的4．03±1．08倍（P=0．000），而MBc組缺血區(qū)Ⅵ值僅為非缺血區(qū)的1．44±0．18倍（P=0．000）。 6．心肌病理及免疫組化檢查結(jié)果：HE染色切片顯示，非缺血區(qū)心肌組織可見心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)無充血水腫，缺血區(qū)心肌可見輕微心肌間質(zhì)水腫、結(jié)締組織疏松，血管周圍可見少量淋巴細(xì)胞浸潤等早期炎癥性

17、改變。免疫組化結(jié)果示，缺血再灌注心肌組織非缺血部位血管內(nèi)皮無明顯P-選擇素表達(dá)，而缺血區(qū)血管內(nèi)皮P-選擇素表達(dá)明顯增加。 結(jié)論： 1．采用“抗生物素蛋白/生物素復(fù)合體”可實(shí)現(xiàn)抗P-選擇素單抗與脂質(zhì)微泡外殼的有效連接而成功構(gòu)建攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡； 2．普通微泡與靶組織的粘附主要是通過非特異的方式通過白細(xì)胞介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的；攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡則主要通過與靶組織血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素直接特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)主動(dòng)