靶向超聲造影劑無創(chuàng)評(píng)價(jià)組織缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著新型超聲造影劑(UCA)的不斷出現(xiàn)和超聲造影新技術(shù)的飛速發(fā)展，明顯提高了超聲診斷心、肝、腎、腦等實(shí)質(zhì)性器官病變的敏感性和特異性，但大多數(shù)超聲造影劑無定向選擇性(即無靶向性)，因此很難對(duì)疾病進(jìn)行特異性的定性及定位診斷。本研究首先制備出用于實(shí)驗(yàn)的表面活性劑超聲造影劑(SPMB)，并初步觀察其理化性質(zhì)，急性動(dòng)物毒性和顯像效果，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步將其制備成對(duì)激活的中性粒細(xì)胞(PMN)具有靶向性的超聲造影劑，觀察其對(duì)腎臟和心肌缺血再灌注損傷的顯

2、像效果并分析與髓過氧化物酶(MPO)的相關(guān)性，并且在體外細(xì)胞水平分析其靶向性作用的可能機(jī)制。 表面活性劑超聲造影劑的制備、安全性及顯像效果的實(shí)驗(yàn)研究 (一)表面活性劑超聲造影劑的制備及其急性毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 以司盤60(Span60)和吐溫80(Tween80)為原材料，經(jīng)高溫加熱熔融，冷卻變性后，最后在聲振同時(shí)緩慢充入八氟丙烷(C3F8)氣體，制備成SPMB微泡，激光粒度散射儀測(cè)量微泡的粒徑分布，血球計(jì)數(shù)儀計(jì)算微泡

3、的濃度，光鏡下觀察微泡的形態(tài)，并觀察隨時(shí)間的延長(zhǎng)微泡粒徑、濃度及形態(tài)的變化。以62只清潔級(jí)小白鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按Bliss法分析SPMB的LD50值。并觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大體解剖改變和鏡下組織學(xué)改變。結(jié)果：光鏡下可見制備成功的SPMB呈圓球型，中空狀，散在分布，大小均勻一致，測(cè)得平均粒徑為2．56±1．20μm，濃度為(7．2±O．8)×109/mL。隨時(shí)間延長(zhǎng)SPMB的粒徑逐漸增大，濃度逐漸降低，形態(tài)未見明顯改變。急性毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)得LD50值

4、為4．Ol(3．67-4．58)mL/kg。大體標(biāo)本可見，心臟充血嚴(yán)重，肺臟膨脹，表面有出血點(diǎn)，肝臟、腎臟未見明顯改變。組織學(xué)觀察可見，心肌血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)內(nèi)有少許紅細(xì)胞，心肌部分橫紋肌斷裂；肺泡壁間毛細(xì)血管內(nèi)見大量紅細(xì)胞，部分肺泡有破壞；肝結(jié)構(gòu)基本正常；腎小球、腎小管基本正常。結(jié)論：聲振法可成功制備SPMB，該造影劑的穩(wěn)定性較好，毒性較弱，可以滿足實(shí)驗(yàn)使用。 (二)表面活性劑超聲造影劑對(duì)犬正常心肌的顯像效果 用上述實(shí)

5、驗(yàn)中制備的SPMB對(duì)七只開胸犬的正常心肌進(jìn)行顯像觀察，將造影劑稀釋10、20、30倍，分別對(duì)心肌進(jìn)行顯像，觀察其不同的顯像效果并對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果：造影劑的劑量在稀釋10倍至30倍之間時(shí)，均是在觸發(fā)間歇為l：8個(gè)心動(dòng)周期時(shí)心肌顯像效果最佳，此時(shí)造影劑在心肌組織內(nèi)達(dá)到飽和狀態(tài)。隨著稀釋倍數(shù)的增加，心肌顯像的視覺效果越弱，后方的聲影也越弱，前壁、后壁心肌和心腔內(nèi)回聲強(qiáng)度也明顯降低，三組之間相互比較，差異有非常顯著性意義(P<0．0

6、1)，只有側(cè)壁心肌沒有明顯改變(P>O．05)。當(dāng)造影劑稀釋20倍時(shí)，心肌顯像視覺效果較明顯，后方聲影不是很強(qiáng)烈，前壁、后壁心肌和心腔內(nèi)回聲強(qiáng)度沒有明顯減低。結(jié)論：SPMB成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)正常心肌組織的顯像，本研究還發(fā)現(xiàn)其稀釋20倍時(shí)的濃度對(duì)心肌組織顯像的效果較理想，最利于觀察心肌血流灌注情況。 二、靶向超聲造影劑評(píng)價(jià)組織缺血再灌注損傷及作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 (一)靶向超聲造影劑評(píng)價(jià)兔腎臟缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究 將S

7、PMB表面結(jié)合上磷脂酰絲氨酸(PS)，制備成對(duì)激活的中性粒細(xì)胞(PMN)具有靶向性的造影劑(SPMB-PS)，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)PS位于微泡的表面，比較SPMB-PS與SPMB的形態(tài)及大小。12只新西蘭大白兔，隨機(jī)分為2組，靶向組(SPMB-PS)和非靶向組(SPMB)，在腎臟缺血一再灌注(I-R)損傷模型建立前后進(jìn)行顯像，然后擬合出造影顯像的時(shí)間-強(qiáng)度曲線(TIC)。另取6只新西蘭大白兔建立腎臟I-R損傷模型，用SPMB-PS對(duì)

8、I-R腎臟進(jìn)行顯像15min后，立即取組織塊進(jìn)行髓過氧化物酶(MP0)活性測(cè)定并進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。最后分析I-R腎臟造影后15min的回聲強(qiáng)度與MPO的關(guān)系。結(jié)果：SPMB-PS與SPMB的形態(tài)及大小基本一致。FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SPMB-PS被AnnexinV-FITC標(biāo)記后，熒光曲線明顯右移，證明了PS結(jié)合在SPMB的表面。從腎臟造影顯像的TIC曲線可見，SPMB-PS與SPMB對(duì)正常腎臟顯像時(shí)，其達(dá)峰時(shí)間和排空時(shí)間基本一致，造影后

9、15min基本排空。對(duì)I-R腎臟顯像時(shí)，其達(dá)峰時(shí)間一致，但SPMB-PS的排空時(shí)間與SPMB比較明顯延遲。SPMB-PS與SPMB對(duì)正常腎臟造影后15min的回聲強(qiáng)度無差異(P>O．05)，而對(duì)I-R腎臟造影后15min的回聲強(qiáng)度的差異有非常顯著性意義(P

10、SPMB-PS在對(duì)I-R。腎臟顯像時(shí)出現(xiàn)延遲排空現(xiàn)象，對(duì)激活的PMN具有靶向性，可以無創(chuàng)評(píng)價(jià)腎臟I-R損傷的嚴(yán)重程度。 (二)靶向超聲造影劑評(píng)價(jià)犬心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究 用SPMB-PS對(duì)9只犬心肌缺血再灌注(I-R)模型，采用延遲顯像的方式進(jìn)行實(shí)時(shí)心臟超聲造影(MCE)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在正常心肌和I-R心肌處取組織塊立即進(jìn)行髓過氧化物酶(MPO)活性測(cè)定。分析I-R心肌部位回聲強(qiáng)度與MP0的相關(guān)性及其標(biāo)化后二者的相

11、關(guān)性。結(jié)果：實(shí)時(shí)MCE顯像發(fā)現(xiàn)I-R心肌部位的造影劑回聲較正常部位的回聲明顯增強(qiáng)。定量分析也表明I-R損傷心肌聲像圖的回聲強(qiáng)度(22．56±4．62GS)明顯增高，與正常心肌(16．57±3．82GS)和缺血心肌(5．00±2．58GS)比較，差異均有顯著性意義(P

12、-R部位，這對(duì)于無創(chuàng)評(píng)價(jià)心肌I-R損傷的嚴(yán)重程度有很大的臨床價(jià)值。 (三)靶向超聲造影劑的作用機(jī)制研究 取2×107個(gè)AnnexinV-FITC標(biāo)記的SPMB-PS與2×106個(gè)白細(xì)胞混合，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定白細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞(PMN)激活前后與SPMB-PS的結(jié)合情況，以及在補(bǔ)體和β2整合素中的Mac-1缺乏時(shí)激活的PMN與SPMB-PS的結(jié)合情況。結(jié)果：未激活的PMN與SPMB-PS的結(jié)合率為(5．27±O．