抗人降鈣素原特異性單克隆抗體的制備及其免疫傳感器的初步研究.pdf

1、細(xì)菌感染導(dǎo)致的抗生素濫用致細(xì)菌耐藥是我國(guó)乃至全球范圍最突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,并且由其導(dǎo)致的膿毒血癥也嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康,成為非心臟ICU死亡的主要原因。普通的細(xì)菌感染本身并不可怕,只要早期診斷明確并針對(duì)性治療,不會(huì)造成嚴(yán)重后果。所以,細(xì)菌感染的早期診斷和鑒別診斷極為重要。臨床常用傳統(tǒng)感染診斷指標(biāo)主要有外周白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血液中C反應(yīng)蛋白(CRP)和血液細(xì)菌培養(yǎng)等,但都存在費(fèi)時(shí)、誤差大、靈敏度低、特異性差等缺點(diǎn),因此,應(yīng)用新的標(biāo)志

2、物來(lái)診斷細(xì)菌感染性疾病非常必要。降鈣素原(PCT)是一種有116個(gè)氨基酸殘基組成、分子量為13kDa的糖蛋白,血清降鈣素的前體物。生理情況下,血中PCT濃度極低,基本檢測(cè)不到,但在一些細(xì)菌感染性疾病,包括細(xì)菌感染引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)、敗血癥或膿毒性休克等患者中血清PCT水平顯著升高,并且和疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此,PCT可作為一種高靈敏的新的炎癥檢測(cè)指標(biāo)。在臨床中,血液中PCT的濃度變化應(yīng)用于多種感染性疾病的診斷與鑒別診斷,可對(duì)感染性疾

3、病進(jìn)行感染程度的判斷和治療效果的評(píng)定,同時(shí),可指導(dǎo)抗生素用藥。PCT的便利、快速和準(zhǔn)確測(cè)定為細(xì)菌性感染的診斷及治療提供了新的可靠依據(jù)。目前PCT的主要測(cè)定方法包括定性(半定量)測(cè)定和定量測(cè)定兩種方式。主流的診斷產(chǎn)品均為國(guó)外進(jìn)口,價(jià)格昂貴。因此,研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、有較高靈敏度和特異性的PCT檢測(cè)技術(shù)和相應(yīng)產(chǎn)品,具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果:
　　1.重組PCT蛋白的原核表達(dá)與純化
　　從GENB

4、ANK獲得PCT編碼基因及其他相關(guān)分子結(jié)構(gòu)等基本信息,通過(guò)Graphicalcodonusageanalyzer(http://guca.schoedl.del)分析密碼子偏性并將基因序列5’端和3’端分別加入酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基后進(jìn)行全基因合成。通過(guò)構(gòu)建PCT原核表達(dá)載體,將PCT的DNA序列克隆入pET28a,再將重組質(zhì)粒pET28a-PCT轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)6h,得到融合蛋白,分子

5、量約15kDa。15％SDS-PAGE鑒定表達(dá)蛋白破菌后在上清里,為可溶性表達(dá)。進(jìn)行鎳金屬螯合層析純化后鑒定,15%SDS-PAGE圖譜顯示幾乎呈單一條帶,分析結(jié)果顯示其純度可達(dá)90%以上。用Lowry氏法測(cè)得蛋白濃度為5mg/ml。純化的重組蛋白PCT經(jīng)特異性鑒定,即為目標(biāo)蛋白,可用于免疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及單克隆抗體制備的篩選。
　　2.抗人PCT單克隆抗體的制備鑒定及初步應(yīng)用
　　依據(jù)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè),綜合分析Chou&Fasma

6、n法預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)β轉(zhuǎn)角、Karplus&Schulz法預(yù)測(cè)蛋白柔韌性、Emini法預(yù)測(cè)抗原表面的可及性、Kolaskar&Tongaonkar法分析蛋白質(zhì)抗原性、Bepipred法預(yù)測(cè)線(xiàn)性抗原表位、Parker法分析蛋白質(zhì)疏水性等獲得三段表位肽。人工合成3個(gè)肽段與BSA交聯(lián)作為免疫原免疫Balb/c小鼠,細(xì)胞融合后通過(guò)復(fù)查及亞型分析保留7株抗體。采集小鼠單抗腹水經(jīng)ProteinAHP.F.F親和純化柱純化,純化后的抗體用間接ELISA法

7、檢測(cè)效價(jià),均在1:64000以上,選出三株結(jié)合能力高、效果好的PCT單克隆抗體2-D7、2-H12、4-H12并對(duì)其抗體其他特性進(jìn)行鑒定。最終選出特異性、效價(jià)和親和力最好的單克隆抗體2-D7用Westernblot和免疫組化進(jìn)一步鑒定其特異性。由Westernblot結(jié)果得出單克隆抗體2-D7能結(jié)合重組PCT抗原,與無(wú)關(guān)蛋白H-FABP不反應(yīng),表明其有好的特異性;免疫組化結(jié)果顯示,2-D7能特異識(shí)別正常甲狀腺及甲狀腺癌組織中PCT蛋白,

8、并初步鑒定PCT抗原在甲狀腺癌組織有較高表達(dá)。
　　之后,用單克隆抗體2-D7作為包被抗體,酶標(biāo)PCT抗體作為檢測(cè)抗體,成功建立了重組蛋白PCT檢測(cè)的ELISA體系。此免疫檢測(cè)體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化后,對(duì)60例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性血清和40例健康體檢血清進(jìn)行了檢測(cè),正常組PCT濃度為4.41±2.76ng/ml,感染組PCT濃度為35.70±15.03ng/ml,結(jié)果顯示二者之間具有顯著性差異(*P<0.05),說(shuō)明建立的配對(duì)抗體檢測(cè)體系能夠區(qū)分正

9、常血清與感染血清之間的差異。再用本研究抗體檢測(cè)體系與安圖公司配對(duì)抗體對(duì)臨床血清進(jìn)行檢測(cè),本研究抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為83.3%,而安圖公司抗體陽(yáng)性率為86.67%,所得結(jié)果表明我們的抗體檢測(cè)水平已基本達(dá)到安圖公司抗體檢測(cè)水平。所得單克隆抗體為下一步PCT檢測(cè)的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　3.抗人PCT免疫傳感器檢測(cè)的初步研究
　　電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器由于其簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)具有良好應(yīng)用前景,尤其在臨床檢測(cè)方面得到

10、越來(lái)越多的關(guān)注。我們首先將玻碳電極在L-Cys中電聚合在表面成膜,同時(shí)制備二抗生物偶合物GRA-Pd-PtNPs@anti-PCT-GOD,通過(guò)層層自組裝修飾于電極表面,加入魯米諾-H2O2共反應(yīng)試劑,ECL信號(hào)顯著增高,達(dá)到理論預(yù)期效果,成功制備了PCT夾心式電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。對(duì)PCT免疫傳感器各項(xiàng)性能進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明免疫傳感器各項(xiàng)性能良好。同時(shí),模擬人體正常環(huán)境加入人血清進(jìn)行PCT檢測(cè),結(jié)果證明該免疫傳感器可以用于臨床實(shí)際樣