新城疫病毒NP基因不同區(qū)域與毒力的相關性.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的對世界養(yǎng)禽業(yè)危害極為嚴重的一種烈性傳染病。NDV的基因組為單股、不分節(jié)段的負鏈RNA，基因組結構模式為：3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，分別編碼核衣殼蛋白(Nucleocapsid，NP)，磷蛋白(Phosphoprotein，P)，基質蛋白(Matrix protein，M)，融合蛋白(Fusion

2、protein，F(xiàn))，血凝集-神經(jīng)氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidaseprotein，HN)和大分子蛋白(Large protein，L)。NP基因共編碼489個氨基酸，其中N端(1-400位氨基酸)比較保守，C端(401-489位氨基酸)在不同病毒之間的差異則比較大。在基因組上，NP基因的非編碼區(qū)同樣屬于高變區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)后期NDV毒株的NP基因非編碼區(qū)出現(xiàn)了6nt插入的現(xiàn)象，而且?guī)в?nt插入的毒株對水禽的致

3、病性明顯增加。2007年我室以基因VII型NDV ZJ1株為骨架，構建了NP基因來源于Beaudette C株的重組嵌合病毒rZJ1/BNP，其毒力與ZJ1株相比明顯減弱，證明NP基因與NDV的毒力存在一定的相關性。為了鑒定NP基因上與毒力相關的區(qū)域，本論文在ZJ1株反向遺傳操作的基礎上，對NP基因上三個主要區(qū)域的生物學功能進行了研究。 1.NP基因非編碼區(qū)與病毒毒力的關系 參照Beaudette C株NP基因序列，設計

4、兩對引物，通過overlapping PCR方法擴增BC株NP基因，并在基因非編碼區(qū)1646-1647之間插入六個堿基“CTCCCA"，利用引物兩端的酶切位點Eco81 I和Sca I將PCR擴增產(chǎn)物與中間質粒NDV7.2相連，陽性質粒經(jīng)Age I和Xba I酶切后連入全長cDNA克隆pNDV/ZJ1中得到了重組質粒pZJ1/SBNP6A。 將重組質粒和三個輔助質粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共轉染BSR-T7/5細胞后

5、，成功拯救出了重組病毒rZJ1/SBNP6A，重組病毒的MDT、ICPI和生長曲線的測定結果顯示：rZJ1/SBNP6A的毒力與rZJ1/SBNP基本相似，均為中強毒，表明NP基因非編碼區(qū)6堿基的插入對病毒毒力幾乎沒有產(chǎn)生影響。 參照Beaudette C和ZJ1株NP基因的序列，分別設計兩對引物，通過overlapping PCR方法構建出編碼區(qū)和非編碼區(qū)分別來源于BC株的兩個NP嵌合基因，以嵌合NP基因替換ZJ1株的相應部分

6、，進而構建了兩個新的全長cDNA克隆pZJ1/SNCR和pZJ1/SORF。全長克隆和輔助質粒一起共轉染BSR-T7/5細胞后，獲得兩個重組嵌合病毒rZJ1/SNCR和rZJ1/SORF。重組病毒的MDT、ICPI和生長曲線測定結果顯示：rZJ1/SNCR為強毒與rZJ1毒力一致；rZJ1/SORF為中強毒，與rZJ1/SBNP毒力相似。表明：決定NDV毒力的區(qū)域主要位于NP基因的編碼區(qū)，而非編碼區(qū)則對病毒的毒力無明顯影響。 2

7、.NP基因保守區(qū)和高變區(qū)與病毒毒力的關系 不同基因型NDV NP蛋白序列比對顯示，不同毒株在整個編碼區(qū)的同源性為89.8-96.5％，第1-400位氨基酸的同源性高達94.2-99％，表明不同時期不同基因型毒株之間氨基酸比較保守，而401-489位氨基酸的同源性僅為50.0-71.1％，不同毒株之間氨基酸差異比較大。為了澄清保守區(qū)和可變區(qū)與病毒毒力之間的關系，本研究通過overlapping PCR方法，將rZJ1 NP基因中的