二甲基甲酰胺染毒致人肝細(xì)胞DNA損傷及維生素C干預(yù)作用研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞為研究對(duì)象，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察不同劑量DMF染毒不同時(shí)間對(duì)肝細(xì)胞增殖活性的影響，探討DMF致肝細(xì)胞損傷的劑量—效應(yīng)關(guān)系和染毒時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系，及不同劑量VitC對(duì)DMF染毒肝細(xì)胞的干預(yù)作用。采用彗星試驗(yàn)(單細(xì)胞凝膠電泳，SCGE法)，觀察不同劑量DMF染毒對(duì)肝細(xì)胞DNA的損傷，及不同劑量VitC對(duì)該損傷的干預(yù)作用，為預(yù)防DMF職業(yè)危害的發(fā)生，保護(hù)作業(yè)工人健康提供理論依據(jù)。 研究目的： 1

2、.探討不同劑量DMF染毒致正常成人肝細(xì)胞生長(zhǎng)損傷及不同劑量VitC的干預(yù)作用。 2.探討不同劑量DMF對(duì)正常人肝細(xì)胞(HL-7702)DNA的損傷以及VitC對(duì)該損傷的干預(yù)作用。 研究方法： 1.將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的肝細(xì)胞制備成密度約5×105cell/ml細(xì)胞懸液，接種于9孔培養(yǎng)板中，每孔200μl細(xì)胞懸液；培養(yǎng)24h后分別以DMF染毒，DMF終濃度為1.56、6.25、25和100mmol/L同樣制備細(xì)胞懸液，

3、每孔加180μl細(xì)胞懸液和20μlVitC溶液，VitC終濃度為0.025、0.05和0.10mmol/L，培養(yǎng)24h后，以25、100mmol/LDMF進(jìn)行染毒，繼續(xù)培養(yǎng)6h、12h、24h。采用噻唑蘭(MTT)比色法觀察DMF染毒致正常成人肝細(xì)胞毒性以及VitC干預(yù)后細(xì)胞生長(zhǎng)變化率。以上均設(shè)陰性組和空白組。細(xì)胞生長(zhǎng)變化率=(處理組吸光度-空白組吸光度)/(陰性組吸光度—空白組吸光度)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)定陰性組生長(zhǎng)變化率為1.00，其余實(shí)驗(yàn)組

4、與陰性組進(jìn)行比較。 2.染毒結(jié)束后，用0.25％胰酶消化細(xì)胞，消化下的細(xì)胞再進(jìn)行吹打，離心洗滌后懸浮于PBS液中。制成細(xì)胞密度大約為4×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，于4℃中保存。采用彗星實(shí)驗(yàn)體外檢測(cè)1.56、6.25、25和100mmol/LDMF染毒6h、12h、24h后肝細(xì)胞DNA的損傷；以及0.025、0.05、0.10和0.25mmol/LVitC預(yù)處理后，100mmol/LDMF染毒6h、24h后肝細(xì)胞DNA的損傷。實(shí)

5、驗(yàn)均設(shè)對(duì)照組和陰性組、陽(yáng)性組，陽(yáng)性組采用10umol/LH2O2染毒，所用的檢測(cè)指標(biāo)為平均尾長(zhǎng)(MTL)和平均尾相(MTM)。 研究結(jié)果： 1.MTT比色實(shí)驗(yàn)： (1)DMF染毒實(shí)驗(yàn)中，各染毒劑量細(xì)胞生長(zhǎng)變化率結(jié)果均低于陰性組，差異有顯著意義，P＜0.01。各個(gè)染毒時(shí)間組內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)變化率有隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)。有明顯的染毒時(shí)間—效應(yīng)。以100mmol/LDMF劑量染毒24h細(xì)胞生長(zhǎng)變化率0.56±0.09

6、為最低。 (2)VitC干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，①VitC干預(yù)+25mmol/LDMF染毒組內(nèi)，0.025和0.05mmol/LVitC劑量干預(yù)的DMF染毒組細(xì)胞生長(zhǎng)變化率組高于非VitC干預(yù)的單純DMF染毒對(duì)照組，而0.10mmol/LVitC劑量干預(yù)的DMF染毒組細(xì)胞生長(zhǎng)變化率組遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非VitC干預(yù)的單純DMF染毒對(duì)照組。②VitC干預(yù)的100mmol/LDMF染毒組內(nèi)，12h和24h組內(nèi)的0.025、0.05mmol/LVitC劑量

7、干預(yù)的DMF染毒組細(xì)胞生長(zhǎng)變化率組均明顯高于非VitC干預(yù)的單純DMF染毒對(duì)照組，而0.10mmol/LVitC干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)變化率組遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非VitC干預(yù)的單純DMF染毒對(duì)照組。 2.彗星實(shí)驗(yàn)： (1)各染毒組MTL值與陰性組比較，差異有顯著意義，P＜0.05。各染毒組MTL值與陽(yáng)性組比較，除6h組內(nèi)的6.25mmol/LDMF染毒劑量組外，其余時(shí)間組內(nèi)6.25、25和100mmol/LDMF染毒組MTL值差異未見(jiàn)顯著

8、意義，P＞0.05。隨著染毒劑量的增加，彗星MTL值隨之變大，有一定的劑量—效應(yīng)關(guān)系；除100mmol/LDMF染毒組外，隨著染毒時(shí)間的增加，各染毒組彗星MTL值隨之變大，有明顯的染毒時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系。各染毒組平均尾相(MTM)值與陰性組比較，差異有顯著意義，P＜0.05。 (2)各VitC干預(yù)組與單純DMF染毒對(duì)照組MTL值比較，差異有顯著意義，P＜0.05；但0.10mmol/LVitC干預(yù)組與陽(yáng)性組比較，MTL值差異未見(jiàn)顯著

9、意義，P＞0.05。VitC干預(yù)劑量為0.025、0.05和0.10mmol/L可以抑制DMF對(duì)肝細(xì)胞DNA損傷作用，而0.25mmol/LvitC干預(yù)劑量對(duì)DMF染毒肝細(xì)胞致DNA損傷沒(méi)有明顯的干預(yù)作用。 研究結(jié)論： 1.MTT實(shí)驗(yàn)中： (1)DMF可抑制體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的增殖。其中以100mmol/LDMF劑量組和24h染毒組細(xì)胞生長(zhǎng)變化率為最低。各個(gè)染毒時(shí)間組內(nèi)，隨DMF劑量增高，細(xì)胞生長(zhǎng)變化率有隨染毒時(shí)間延

10、長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)。 (2)0.025和0.05mmol/LVitC有降低DMF染毒引起細(xì)胞損傷的作用。而0.10mmol/LVitC在一定程度上有促進(jìn)體外DMF染毒致肝細(xì)胞損傷的作用。 2.彗星實(shí)驗(yàn)中： (1)不同劑量DMF處理肝細(xì)胞后，DNA均有不同程度的損傷；并且有隨著染毒劑量的加大，肝細(xì)胞DNA“彗星”的尾長(zhǎng)值和尾相值逐漸增加的趨勢(shì)。 (2)0.025、0.05和0.10mmol/LVitC干預(yù)24h