二甲基甲酰胺通過線粒體通路誘導H9c2心肌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：
　　探討線粒體通路是否參與了二甲基甲酰胺（DMF）誘導H9c2心肌細胞凋亡的過程，以及細胞氧化還原水平的改變與該與通路的激活是否有關。
　　方法：
　　觀察DMF對H9c2心肌細胞形態(tài)以及核形態(tài)的影響。用westernblotting（WB）檢測不同劑量DMF（0 mM，50 mM，100 mM，200 mM）染毒24h后胞漿內(nèi)全長Caspase-3（Procaspase-3）、活化的Caspase-3（Cle

2、aved caspase-3）、全長Caspase-9（Procaspase-9）、Bax、Bcl-2、細胞色素C（Cyt-c）水平的改變；檢測200 mM DMF染毒不同時間后（0h，2h，4h，8h，12h，24h）以及4 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）預作用1h繼而200 mM DMF作用24h后胞漿內(nèi)Cleaved caspase-3，Bcl-2，Cyt-c水平的變化。采用免疫熒光細胞化學法（IFC）對200 mM DMF染毒

3、不同時間后（0h，2h，4h，8h，12h，24h）以及4 mM NAC干預1h繼而200 mM DMF染毒24h后細胞內(nèi)Cyt-c進行定位,觀察細胞內(nèi)Cyt-c的變化動態(tài)。
　　結果：
　　200 mM DMF染毒24h后大部分細胞皺縮、部分細胞變圓并脫離培養(yǎng)瓶壁懸浮到培養(yǎng)基中；部分細胞核染色質出現(xiàn)不同程度的濃縮現(xiàn)象。不同劑量DMF（0 mM，50mM，100 mM，200 mM）染毒24h后胞漿Procaspase-3和

4、Bax水平有升高，Procaspase-9和Bcl-2水平降低，Cleaved caspase-3和Cyt-c水平升高，組間差異有統(tǒng)計學意義（Procaspase-3：F=16.11，P=0.0009；Bax：F=60.31，P＜0.0001；Procaspase-9：F=16.66，P=0.0008；Bcl-2：F=577.8，P＜0.0001；Cleaved caspase-3：F=23.33，P=0.0003；Cyt-c：F=10

5、4.0，P＜0.0001）。Procaspase-3、Bax在50 mM、100 mM染毒組較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），200 mM染毒組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。Procaspase-9在50 mM、100 mM染毒組較與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，200 mM染毒組較對照降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Bcl-2水平在50 mM、100 mM、200 mM染毒組較對照組均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0

6、.05）。Cleaved caspase-3和Cyt-c水平在100 mM、200 mM染毒組較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Cleaved caspase-3/Total caspase-3和Bax/Bcl-2比值增加，100 mM，200 mM組較對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。200 mM DMF染毒不同時間后（0h，2h，4h，8h，12h，24h）胞漿內(nèi)Cleaved caspase-3，Cyt-c水平

7、升高，Bcl-2水平降低，組間差異均有統(tǒng)計學意義（Cleaved caspase-3：F=503.7，P＜0.0001；Cyt-c：F=51.42，P＜0.0001；Bcl-2：F=73.37，P＜0.0001）。Cleaved caspase-3水平在200 mM DMF染毒后各時間點較對照組均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Cyt-c水平在200 mM DMF染毒2h，4h，8h時間點與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，12h、

8、24h時間點較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Bcl-2水平在在200 mM DMF染毒后各時間點較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。4 mM NAC干預1h繼而200 mM DMF染毒24h、200 mM DMF染毒24h、4 mM NAC單獨干預1h和對照組組間Cleaved caspae-3、Cyt-c、Bcl-2水平差異有統(tǒng)計學意義（Cleaved caspase-3：F=28.98，P＜0.0001；

9、Cyt-c：F=26.14，P=0.0002；Bcl-2：F=18.52，P=0.0006）。4 mM NAC干預1h繼而200 mM DMF染毒24h后Cleaved caspase-3、Cyt-c水平較200 mM DMF染毒組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。4 mM NAC干預1h繼而200 mM DMF染毒24h后Bcl-2水平較200 mM DMF染毒組升高，然而差異無統(tǒng)計學意義。IFC檢測發(fā)現(xiàn)對照組大部分細胞中Cyt

10、-c呈粒點狀分布在胞漿中，單獨Cyt-c熒光染色可見細胞核輪廓清晰，隨著染毒時間的延長幾乎所有細胞的Cyt-c彌散分布于胞漿中，核輪廓越來越模糊。4 mM NAC干預1h繼而200 mM DMF染毒24h后少部分細胞胞漿內(nèi)可見Cyt-c隨線粒體呈粒點狀分布，且單獨Cyt-c熒光染色時可見細胞核輪廓變清晰。
　　結論：
　　DMF染毒后可上調(diào)胞漿中Cleaved caspase-3、Cyt-c水平，下調(diào)Bcl-2水平，Clea