HIV-1包膜糖蛋白gp120s在大腸桿菌中的表達(dá)純化和初步應(yīng)用.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(HIV)是引起艾滋病的病原體，分為兩型：HIV-1和HIV-2，主要為HIV-1。它和一般的病毒有明顯的差別，首先是其基因組相對復(fù)雜，編碼更多的蛋白質(zhì)來調(diào)控病毒潛伏、激活、轉(zhuǎn)錄與復(fù)制等過程，其次是它在宿主個體內(nèi)變異迅速。鑒于HIV-1包膜糖蛋白gpl20是HIV-l的主要抗原成分，是檢測HIV抗體診斷試劑盒的重要組成成分，也是制備抗gpl20單克隆抗體必需的免疫原，應(yīng)用廣泛，意義十分重大。本研究利用分子生物學(xué)手段，將g

2、pl20的部分編碼基因(命名為印120s)重組到大腸桿菌的表達(dá)載體中，并成功地進(jìn)行了蛋白表達(dá)。 外膜糖蛋白gpl20s的編碼基因的克隆和在大腸桿菌中的表達(dá)。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR從HIV-1型國際標(biāo)準(zhǔn)株pHXB2-gpl60的基因序列中擴(kuò)增出糖蛋白片段基因5。3Top，插入質(zhì)粒pET32a中構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gpl20s，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后獲得了高效表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE和免疫印跡分析其

3、表達(dá)產(chǎn)物證實蛋白得到表達(dá)且主要存在于包涵體中，凝膠掃描成像分析證實其表達(dá)量占菌體總蛋白的45.35％。在誘導(dǎo)4個小時蛋白表達(dá)量最大，以包涵體的形式表達(dá)。包涵體經(jīng)過洗滌、溶解、復(fù)性和過鎳柱后，其純度達(dá)到85％，表明已獲得高純度的目的蛋白。用純化的重組gpl20蛋白作為包被抗原，間接ELISA對5份已知HIV陽性血清中的gpl20抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該純化蛋白具有一定的抗原活性，能特異性地與HIV抗體反應(yīng)。 本研究在大腸桿菌中成功

4、表達(dá)了gpl20s蛋白，為進(jìn)一步發(fā)展H1V診斷試劑，研究AIDS~單位疫苗奠定了一定的基礎(chǔ)，為研究HIV主要抗原蛋白的性質(zhì)提供可能，也為制備HIV-1的診斷抗原和基因工程重組疫苗打下基礎(chǔ)。 人細(xì)胞色素2A6作為細(xì)胞色素P450家族中重要的一員在許多藥物的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究利用體外重組技術(shù)，克隆及表達(dá)CYP2A6野生株，建立了一個研究CYP2A6酶的平臺。通過對野生型進(jìn)行酶動力學(xué)分析和藥物抑制高通量篩選，測定酶動力

5、學(xué)常數(shù)和藥物抑制常數(shù)，所得數(shù)據(jù)可為以后研究其多態(tài)性等位基因在藥物代謝中的作用和在新藥開發(fā)早期進(jìn)行新藥評價提供重要的信息。 通過定點突變法得到CYP2A6野生型的cDNA(1.5Kb)，并將之克隆到酵母表達(dá)載體pYES2/CT上，通過測序得以證實；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已經(jīng)整合了細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因(POK)的釀酒酵母中，半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，利用SDS-PAGE和Western Blot分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明菌株得到表達(dá)，所得

6、蛋白約為55Kd，與預(yù)期大小相同。大量誘導(dǎo)高表達(dá)菌株并制備微粒體蛋白，將所制備的微粒體用CO還原示差光譜法進(jìn)行P450含量測定，在450nm處有吸收峰，含量為23.8 pmol/mg。 用適量微粒體蛋白與2.A6特異性熒光底物Coumarin進(jìn)行酶學(xué)反應(yīng)，所得數(shù)據(jù)用非線性回歸分析法計算出Km值、Vmax值和內(nèi)在清除率CLint值(Vmax/Km)，結(jié)果表明：酶活很好，得到相應(yīng)值均與相關(guān)報導(dǎo)相近。將底物濃度固定，與系列濃度的抑制劑

7、共同孵育，用熒光檢測技術(shù)測定已知抑制劑對重組CYP2.A6野生型酶的抑制常數(shù)。 本文同時用高效液相色譜法初步檢測CYP4502A6的酶動力學(xué)，摸索條件，所得數(shù)據(jù)同熒光分析法計算其Km值、Vmax值和內(nèi)在清除率CLint值(Vmax/Km)，與熒光分析法比較，具有非常好的一致性，在說明這個酶穩(wěn)定性好的同時，也說明這兩種方法的科學(xué)一致性，使實驗結(jié)果更加可信。 本研究成功構(gòu)建了CYP2A6野生型基因的釀酒酵母表達(dá)體系，所誘導(dǎo)制