tatnlsnkx6.2融合蛋白在大腸桿菌中的表達純化及其在腦中分布的初步研究

1、天津醫(yī)科大學碩士學位論文TAT--NLS--Nkx6.2融合蛋白在大腸桿菌中的表達純化及其在腦中分布的初步研究姓名：汪蓓蕾申請學位級別：碩士專業(yè)：生物學；生物化學與分子生物學指導教師：郭剛2012-05天津醫(yī)科大學碩士學位論文A b s t r a c tH o m e o d o m a i n t r a n s c r i p t i o nf a c t o rN k x 6 ．2p l a y sa c r i t i c a

2、 lr o l ee m b r y o n i c a l l yi nn e u r o b l a s t e sa n d p o s t n a t a l l yi n o l i g o d e n d r o c y t e s ．O u rp r e v i o u s s t u d yi n d i c a t e dt h a tt h y r o i dh o r m o n ed e f i c i e n

3、c yd u r i n gn e r v o u s s y s t e md e v e l o p m e n t c a u s e sa l t e r e dn o b l en e r v o u s c e l l s w i t h r e d u c e d e x p r e s s i o n o f N k x 6 ．2 ．H o w e v e r ，t h e e f f e c t s o fd o w

4、n —r e g u l a t e d N k x 6 ．2 i n t h e b r a i n d e v e l o p m e n tr e t a r d a t i o n c a u s e d b y t h y r o i dh o r m o n ed e f i c i e n c y h a v en o t b e e nc h a r a c t e r i z e d ．B ya d m i n i s

5、 t r a t i o n o fe x o g e n o u sN k x 6 ．2 t 0 t h e m o d e l o fH y p o t h y r o i d i s m ，t h i sp r o b l e mm a yb e s o l v e d ，o r p a r t l ys o l v e d ．M o r e o v e r ，I n c o n t r a s t t o c o n v e n

6、 t i o n a l g e n e t r a n s f e r s t r a t e g i e s ，t h e d i r e c ti n t r o d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n i n t o c e l l s b y p a s s e s t h e r i s k o f i n s e r t i o n a lm u t a

7、g e n e s i s a n d o f f e r sa na l t e r n a t i v eg e n e t i c i n t e r v e n t i o n ．S oi nt h i sr e s e a r c h ．w ee n g i n e e ra T A T - p r o t e i n t r a n s d u c t i o nd o m a i nf T A T - P T D )a n

8、 dn u c ] e a r l o c a t i o ns e q u e n c e ( N L S ) i n t o t r a n s c r i p t i o nf a c t o rN k x 6 ．2p r o t e i n ．f i r s t l y ：w ee x t r a c tt h et o t a lR N A f r o m t h er a tb r a i na n d r e v e r

9、s et r a n s c r i b e d t oe D N A ，p e r f o r mp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( P C R ) t oc l o n et h ee x o n s o f r a tN k x 6 ．2c o d i n gg e n ew h i l et h ec o d i n gs e q u e n c e s o f T A T

10、 a n d N L S a r es y n t h e s i z e d c h e m i c a l l yi nv i t r o ．A n dt h e nt h et a r g e ts e q u e n c e s a r e i n s e r t e di n t op r o k a r y o t i cf u s i o ne x p r e s s i o n v e c t o rp Q E 一3 0

11、 X a ．F i n a l l y t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p Q E 一3 0 X a ／T A T - N L S - N k x 6 ．2 ( T N - N k x 6 ．2 ) i st r a n s f o r m e di n t o E ．c o l iM 15 [ p R E P 4 ] f o r e x p r e s s i o n ．A t t

12、h e e n d ，a r e c o m b i n a n tc e l l - p e r m e a n t f o r m o f N k x 6 ．2 p r o t e i n i s g e n e r a t e d ．L a b e l e d w i t hC y 7 - N ·h y d r o x y s u c c i n i m i d ee s t e r ( C y 7N H S ) ．t

13、h i sp r o t e i ni si ．V ．i n j e c t e d i n t ot h et a i lv e i n o fK Mm i c e ．U s i n g t h e i n v i v o i m a g i n gs y s t e m a n d i m m u n o f l u o r e s c e n c eh i s t o c h e m i s t r 3 ’，w e f i n d

14、 t h a t T N —N k x 6 ．2 c a n p a s s t h r o u g h t h e b l o o d - b r a i nb a r r i e r ( B B B la n d b i o m e m b r a n e e f f i c i e n t l ya n d i t s e l fh a s n oo b v i o u s l y b i o t o x i c i t y ．K