流產(chǎn)布魯菌脂多糖單克隆抗體的制備及Asp24蛋白的功能研究.pdf

1、牛布魯菌病是一種由流產(chǎn)布魯菌感染引起的人畜共患細菌性傳染病，呈全球性分布。布魯菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，革蘭氏染色呈陰性，沒有質(zhì)粒、莢膜，外毒素等經(jīng)典的毒力因子，布魯菌的毒力主要體現(xiàn)在其具有入侵宿主細胞并在胞內(nèi)增殖的能力。布魯菌致病機制研究為預防和控制該病提供重要基礎，目前鑒別診斷和新疫苗研發(fā)是控制布魯菌病面臨的兩個主要問題。
　　動物感染布魯菌后產(chǎn)生的針對其脂多糖的抗血清可用于診斷人畜布魯菌病。本研究采用傳統(tǒng)的細胞融合技術，通過流

2、產(chǎn)布魯菌S2308脂多糖篩選獲得一株穩(wěn)定分泌抗流產(chǎn)布魯菌脂多糖抗體的單克隆細胞株，命名為51C，并成功制備流產(chǎn)布魯菌脂多糖單克隆抗體。交叉反應性實驗表明，本研究得到的單克隆抗體與流產(chǎn)布魯菌S2308、豬種布魯菌1330的脂多糖均有良好的反應性，與馬耳他布魯菌16M、大腸桿菌O157和鼠傷寒沙門菌SL1344的脂多糖不反應，與小腸結(jié)腸耶爾森菌O:9型的脂多糖有輕微交叉反應。因此，推測本研究獲得的單克隆抗體作用表位為脂多糖的A表位。本研究為

3、進一步建立高特異性的布魯菌檢測方法奠定基礎。
　　Asp24是布魯菌一個重要的毒力相關蛋白，該蛋白在酸性條件下能夠誘導表達，asp24基因缺失株作為候選疫苗株具有較大的應用潛力。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，脂多糖O-抗原的胞內(nèi)聚集可以誘導asp24基因上調(diào)表達，協(xié)助布魯菌胞內(nèi)存活。然而，目前對Asp24蛋白的功能研究并不清楚。本研究首先通過定向缺失技術成功構(gòu)建了△asp24缺失株，生長曲線測定發(fā)現(xiàn)，Asp24對細菌的生長影響不明顯，

4、細胞感染試驗發(fā)現(xiàn)Asp24對布魯菌胞內(nèi)存活無影響，動物感染試驗證明Asp24與布魯菌在小鼠體內(nèi)早期建立感染無關，而對布魯菌在小鼠體內(nèi)建立慢性感染發(fā)揮著重要作用。
　　為進一步探究Asp24的功能，后續(xù)對Asp24的誘導條件和蛋白活性進行深入分析。在熱應激條件下，Asp24的表達出現(xiàn)顯著下調(diào)。啟動子活性分析發(fā)現(xiàn)，基因開放閱讀框(ORF)前89bp是asp24基因表達所必需的，而前126bp的片段是布魯菌在酸性環(huán)境下誘導表達asp24

5、基因所必需的。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Asp24蛋白存在3個典型的鈣離子結(jié)合型EF手型結(jié)構(gòu)域，為驗證Asp24蛋白的鈣離子結(jié)合活性，本研究表達和純化了野生型和突變型Asp24蛋白，采用SDS-PAGE分析Asp24蛋白電泳遷移率變化，發(fā)現(xiàn)Asp24結(jié)合鈣離子后電泳速率顯著加快，而突變體蛋白電泳速率無變化，表明Asp24確實可以結(jié)合鈣離子。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Asp24在布魯菌內(nèi)的表達水平與布魯菌所處環(huán)境中鈣離子濃度相關，預示細菌可能通過調(diào)控Asp