鴨坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立.pdf

1、本研究利用RT-PCR方法擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒（DTMUV）奉賢株（FX2010）的結(jié)構(gòu)蛋白E基因，并將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E。將其轉(zhuǎn)化受體菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE和Western Blot試驗(yàn)分析表明，E基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，并且可與DTMUV鴨陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具備良好的抗原性。
　　本研究利用純化的DTMUV奉賢

2、株（FX2010）作為包被抗原，建立了檢測DTMUV血清抗體的間接ELISA方法，并對各種檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后確定的抗原最適包被濃度為1.675μg/孔，抗原最佳包被條件為37℃放置2 h后，4℃下過夜，血清的最佳稀釋度為1:200，酶標(biāo)抗體最適稀釋度為1:2000。在優(yōu)化條件下，陰陽性臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)為0.432。結(jié)果顯示，本次試驗(yàn)建立的間接ELISA方法具有良好的特異性、穩(wěn)定性和敏感性。
　　本研究利用純化的鴨坦布蘇病毒奉

3、賢株（FX2010）免疫 BALB/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，篩選獲得3株能夠穩(wěn)定分泌抗DTMUV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為：J1-E5-E4、7B5和1E5-B6，3株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)腹腔注入同品系小鼠后產(chǎn)生的抗體ELISA效價(jià)達(dá)到1:12800、1:6400和1:25600。間接ELISA和IFA結(jié)果顯示，3株單抗均可以與 DTMUV發(fā)生特異性反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，J1-E5-E4可以與DTMUV-E蛋白結(jié)合，使得表達(dá)E蛋