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1、本研究利用RT-PCR方法擴增鴨坦布蘇病毒(DTMUV)奉賢株(FX2010)的結(jié)構(gòu)蛋白E基因,并將其克隆至原核表達載體pET32a,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a-E。將其轉(zhuǎn)化受體菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進行表達。SDS-PAGE和Western Blot試驗分析表明,E基因在大腸桿菌中得到了表達,并且可與DTMUV鴨陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具備良好的抗原性。
本研究利用純化的DTMUV奉賢
2、株(FX2010)作為包被抗原,建立了檢測DTMUV血清抗體的間接ELISA方法,并對各種檢測條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后確定的抗原最適包被濃度為1.675μg/孔,抗原最佳包被條件為37℃放置2 h后,4℃下過夜,血清的最佳稀釋度為1:200,酶標抗體最適稀釋度為1:2000。在優(yōu)化條件下,陰陽性臨界值判定標準為0.432。結(jié)果顯示,本次試驗建立的間接ELISA方法具有良好的特異性、穩(wěn)定性和敏感性。
本研究利用純化的鴨坦布蘇病毒奉
3、賢株(FX2010)免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴細胞雜交瘤技術(shù),篩選獲得3株能夠穩(wěn)定分泌抗DTMUV單克隆抗體的雜交瘤細胞,分別命名為:J1-E5-E4、7B5和1E5-B6,3株雜交瘤細胞經(jīng)腹腔注入同品系小鼠后產(chǎn)生的抗體ELISA效價達到1:12800、1:6400和1:25600。間接ELISA和IFA結(jié)果顯示,3株單抗均可以與 DTMUV發(fā)生特異性反應(yīng)。進一步研究發(fā)現(xiàn),J1-E5-E4可以與DTMUV-E蛋白結(jié)合,使得表達E蛋
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