大鼠口腔黏膜移植模型的建立及其免疫病理學(xué)特征的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 口腔黏膜是機(jī)體黏膜免疫體系的重要組成部分之一。作為呼吸道、消化道黏膜的共同始端,口腔黏膜是機(jī)體免疫防御的第一道防線。外傷、頜面部炎癥、腫瘤等容易導(dǎo)致口腔黏膜的缺損。口腔黏膜移植是修復(fù)大面積口腔黏膜缺損有效的方法之一。但有關(guān)口腔黏膜移植的研究罕見(jiàn)報(bào)道,分析因?yàn)橹饕梢韵聨c(diǎn):口腔黏膜組織薄弱且張力大,原位縫合困難；容易被口腔微生物感染；往往涉及復(fù)合組織移植,操作難度大等?，F(xiàn)有研究多以裸鼠作為口腔黏膜移植的受體,但

2、免疫力存在缺陷的裸鼠不能反映免疫力正常正常動(dòng)物的真實(shí)病理特征及過(guò)程；部分牙周病治療采用自體牙齦冠向移植來(lái)修復(fù)附著喪失或牙齦萎縮,該方法屬于同源移植,其病理過(guò)程通常不涉及免疫排斥。缺乏合適的動(dòng)物模型已經(jīng)成為口腔黏膜移植相關(guān)研究的主要瓶頸。因此,有必要建立一個(gè)適用于進(jìn)行口腔黏膜移植免疫病理學(xué)研究的動(dòng)物模型。
　　 現(xiàn)有研究認(rèn)為,組織移植與器官移植在免疫排斥的表現(xiàn)、機(jī)制及組織病理學(xué)特點(diǎn)等方面均有明顯不同,此外組織移植的免疫病理學(xué)特征也

3、因部位不同而差別顯著。因此,其它器官或組織移植的研究方法、研究結(jié)果只能被參考而不能直接用于口腔黏膜移植。作為組織移植的一種,口腔黏膜移植的相關(guān)研究嚴(yán)重滯后于其它器官或組織移植。主要反映在兩方面:其一,迄今口腔黏膜移植基本的病理學(xué)特征、病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)與分期情況等尚未完全明了；其二,口腔黏膜移植后的免疫學(xué)特征及機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。移植免疫本質(zhì)上也是一種炎癥反應(yīng),移植后浸潤(rùn)細(xì)胞及分泌細(xì)胞因子的種類(lèi)、數(shù)量是決定機(jī)體或組織局部移植炎癥反應(yīng)是否發(fā)生、

4、發(fā)生強(qiáng)度以及有何特點(diǎn)的關(guān)鍵因素。細(xì)胞與細(xì)胞因子間的相互作用還是移植炎癥反應(yīng)主要的調(diào)控因素。采用常規(guī)方法很難全面了解過(guò)程復(fù)雜、參與成分多樣的移植炎癥反應(yīng)特征,因此如何高效全面地進(jìn)行上述免疫學(xué)分析是另外一個(gè)影響口腔黏膜移植研究的難題和瓶頸。生物芯片技術(shù)已經(jīng)成為高通量分析生物系統(tǒng)性能最重要的平臺(tái)之一。目前,該技術(shù)已被廣泛用于包括唾液診斷學(xué)、口腔微生物的致病基因篩選、口腔鱗癌標(biāo)記物與相關(guān)基因篩選、口腔扁平苔蘚相關(guān)基因篩選等口腔疾病的多個(gè)研究領(lǐng)域

5、。第二代功能基因組芯片,又稱(chēng)PCR芯片,可根據(jù)研究目的將百余個(gè)功能相關(guān)基因(如炎癥相關(guān)基因組、通路相關(guān)基因組等)集合在同一張芯片上,在一次反應(yīng)中完成所有基因的熒光定量PCR檢測(cè)。與傳統(tǒng)基因芯片相比,其的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在針對(duì)性強(qiáng)、可以直接使用無(wú)需驗(yàn)證、準(zhǔn)確率高等方面。PCR芯片的特有優(yōu)勢(shì)將為全面分析口腔黏膜炎癥的免疫特征及機(jī)制提供可能。
　　 第一章大鼠口腔黏膜異種異體移植模型的建立與觀察
　　 1.研究目的:
　　 以

6、建立的口腔黏膜移植模型為研究工具,明確口腔黏膜移植的主要病理學(xué)特征并以此為基礎(chǔ)提出口腔黏膜移植的病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)口腔黏膜移植反應(yīng)進(jìn)行病理分級(jí)。
　　 2.研究方法:
　　 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 將200只Wistar大鼠按照按照處理方式不同分為以下三組:
　　 移植組(Xenograft,X組):將Balb/C小鼠的舌組織移植到Wistar大鼠左側(cè)頰黏膜下,其右側(cè)頰黏膜不做處理(n=80)

7、；
　　 創(chuàng)傷組(Trauma,T組):對(duì)Wistar大鼠左側(cè)頰黏膜進(jìn)行與X組相同的創(chuàng)傷及縫合但不移植組織,其右側(cè)頰黏膜不做處理(n=80)；
　　 正常對(duì)照組(Normal,N組):雙側(cè)頰黏膜均不做任何處理(n=40)。
　　 (2)取材時(shí)點(diǎn):
　　 在術(shù)后1天(D1)、D3、D7、D10、D15、D21、D30、D48、D72及D90共10個(gè)時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物并取材(D1組只用于組織學(xué)觀察)。每時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選取

8、X組6只、T組6只,N組4只。
　　 (3)大體觀察與測(cè)量
　　 觀察指標(biāo)包括:大鼠48天生存率(Survival rate,SR=存活大鼠數(shù)目/參與實(shí)驗(yàn)大鼠總數(shù))；體重變化百分比(Percent body weight changes,PBW=術(shù)后觀察當(dāng)日體重/手術(shù)前初始體重×100％)；頰黏膜的腫脹和滲出情況；淋巴結(jié)指數(shù)(Indexof lymph nodes,ILN=左側(cè)3個(gè)最大淋巴結(jié)直徑之和一右側(cè)3個(gè)最大淋巴結(jié)直

9、徑之和,取絕對(duì)值)；脾臟/體重比值(Spleen-to-body weight ratios,SBR=脾臟重量/體重×100％)。
　　 (4)外周血檢測(cè)
　　 檢測(cè)指標(biāo)包括血常規(guī)和血清免疫五項(xiàng)(IgG、IgA、IgM、C3、C4)。
　　 (5)組織病理學(xué)觀察
　　 取下整個(gè)頰黏膜,按組織病理學(xué)常規(guī)方法固定、包埋、切片、HE染色,普通光鏡下觀察分析；以病損組織的中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度、異種移植物損傷與修復(fù)

10、的情況為基礎(chǔ)進(jìn)行病理分級(jí),分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:
　　 G1:無(wú)明顯組織結(jié)構(gòu)破壞區(qū)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；
　　 G1:壞死、膿腫區(qū)大部分由纖維或膠原組織包裹或替代,伴少量組織細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),罕見(jiàn)中性粒細(xì)胞；
　　 G2:壞死區(qū)被較多增生的纖維組織環(huán)繞并逐漸被吸收,面積減少?？梢?jiàn)較多的巨噬細(xì)胞、組織細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞、膿細(xì)胞浸潤(rùn)；
　　 G3:少量或部分移植物出現(xiàn)壞死,伴中等

11、量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；
　　 G4:部分或全部移植物凝固性壞死,伴密集的中性粒細(xì)胞或膿細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 3.結(jié)果:
　　 (1)大體觀察:
　　 生存率:X組48天SR為87.50％,與T組和N組無(wú)顯著差別；
　　 體重:X組和T組術(shù)后體重均顯著下降,X組需要10天恢復(fù)初始體重而T組只需6天；
　　 口腔局部:X組術(shù)后3天口腔黏膜開(kāi)始腫脹,7-15天腫脹、溢膿明顯,以后逐漸減輕,30天左右基

12、本消退；
　　 淋巴結(jié)腫大:X組術(shù)后7-15天SMLN顯著腫大；X-D7組的ILN明顯高于N-D7組,X-D10組顯著高于T-D10組及N-D10組；
　　 脾臟腫大:各組的SBR在所有檢測(cè)時(shí)點(diǎn)均無(wú)明顯差別。
　　 (2)外周血檢測(cè)結(jié)果:
　　 各實(shí)驗(yàn)組的的血常規(guī)和血清免疫五項(xiàng)在所有檢測(cè)時(shí)點(diǎn)均無(wú)明顯差別。
　　 (3)組織學(xué)觀察及病理分級(jí)情況
　　 免疫病理特征:移植早期以移植物的壞死伴中

13、性粒細(xì)胞突出浸潤(rùn)為特點(diǎn),以天然免疫為主導(dǎo)；后期以壞死物的吸收、組織的修復(fù)伴巨噬細(xì)胞及組織細(xì)胞、漿細(xì)胞、T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)為特征,是天然免疫與適應(yīng)性免疫共同作用的結(jié)果。
　　 按照本研究提出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),口腔黏膜異種異體移植排斥反應(yīng)90天的觀察期可被分為如表1.2所示的0-4級(jí),按出現(xiàn)順序概述如下:術(shù)后一周內(nèi)主要以3級(jí)病理表現(xiàn)為主,D1組、D3組91.67％(11/12)的大鼠屬于病理3級(jí)；術(shù)后7-15天,病理表現(xiàn)主要為炎癥反應(yīng)

14、最嚴(yán)重的4級(jí),D7組、D10及D15組83.33％(15/18)大鼠屬于病理4級(jí)；術(shù)后21-30天以2級(jí)病理表現(xiàn)為主,D21組、D30組91.67％(11/12)的大鼠屬于病理4級(jí)；30天后到72天左右,1級(jí)病理表現(xiàn)明顯,D48組6只大鼠均屬于病理1級(jí)；移植術(shù)后72-90天,病理表現(xiàn)為1級(jí)向0級(jí)過(guò)渡,D72組、D90組83.33％(10/12)的大鼠屬于病理0級(jí)。
　　 4.結(jié)論:
　　 本研究初步了建立口腔黏膜異種異體

15、移植模型,為深入開(kāi)展口腔黏膜移植免疫學(xué)研究提供了良好的研究工具；首次明確了口腔黏膜異種異體移植主要的病理學(xué)特征,并以此為基礎(chǔ)提出病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)90天觀察期的口腔黏膜移植反應(yīng)進(jìn)行了相應(yīng)的病理分級(jí)。
　　 第二章中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是大鼠口腔黏膜移植的早期事件
　　 1.研究目的:
　　 比較口腔黏膜移植早、晚期髓過(guò)氧化物酶(MPO)相對(duì)含量,以定量分析方式明確中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)規(guī)律；進(jìn)行Fk506干預(yù)實(shí)驗(yàn)以明確

16、中性粒細(xì)胞在移植早期所起的作用。
　　 2.研究方法:
　　 (1)建模及分組:
　　 按照第一章方法建立移植組(X,n=24)、創(chuàng)傷組(T,n=24)和正常組(N,n=16)動(dòng)物模型。其中X組、T組各12只,N組8只大鼠接受FK506處理(術(shù)前3天,2mg/kg/d加術(shù)后7天0.5 mg/kg/d口服灌胃),分別命名為FX組、FT組及FN組。
　　 (2)取材及樣本制備
　　 分別于術(shù)后D7、D

17、30處死X組、T組及N組大鼠,每時(shí)點(diǎn)取X組6只、T組6只,N組4只。去皮后取下整個(gè)頰黏膜和頜下淋巴結(jié),液氮凍存?zhèn)溆谩?br>　　 術(shù)后D7處死FX組、FT組及FN組大鼠,其中FX組12只、T組12只,N組8只。半數(shù)取下其整個(gè)頰部組織(從皮膚側(cè)到黏膜側(cè)),置于10％的中性福爾馬林中固定；半數(shù)去皮后取下整個(gè)頰黏膜及頜下淋巴結(jié),液氮凍存?zhèn)溆谩?br>　　 (3)ELISA方法檢測(cè)各組D7、D30口腔黏膜和/或SMLN中MPO含量。

18、　　 (4)其余觀測(cè)指標(biāo)包括:口腔黏膜腫脹、滲出情況及頜下淋巴結(jié)腫大情況等。
　　 3.結(jié)果:
　　 (1)各組D7、D30口腔黏膜MPO表達(dá)情況:
　　 X-D7組MPO水平顯著高于T-D7組、N-D7組及X-D30組(三組間P<0.001)；X-D30組的MPO水平顯著高于N-D30組(P=0.042)。
　　 經(jīng)Fk506處理后,病損組織MPO水平:FX-D7組較X-D7組顯著下降(p=0.005

19、),仍高于FT-D7組及FN-D7組(P值分別為0.001和0.019)。
　　 淋巴結(jié)MPO水平:Fk506處理前、后各組頜下淋巴結(jié)處MPO的表達(dá)無(wú)顯著變化(P值均>0.05)。
　　 (2)Fk506處理前后各組大體及組織學(xué)情況
　　 另外還發(fā)現(xiàn),經(jīng)FK506處理的動(dòng)物頰黏膜的腫脹、滲出及頜下淋巴結(jié)腫大明顯緩解；中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)及移植物的破壞程度均明顯減輕。
　　 4.結(jié)論:
　　 以中性粒細(xì)

20、胞為代表的天然免疫細(xì)胞在口腔黏膜移植早期發(fā)揮重要作用,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是口腔黏膜移植的早期事件,加劇了移植排斥反應(yīng)。
　　 第三章口腔黏膜移植中炎癥性細(xì)胞因子趨化因子表達(dá)譜研究
　　 1.研究目的:
　　 應(yīng)用大鼠炎癥性細(xì)胞因子趨化因子PCR芯片檢測(cè)口腔黏膜移植早、晚期多種炎性細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)情況,以篩選出與移植相關(guān)的差異基因并探討差異基因的生物學(xué)功能,以揭示口腔黏膜移植主要的免疫學(xué)特點(diǎn)和機(jī)制,為有效控制口

21、腔黏膜移植排斥提供研究基礎(chǔ)。
　　 2.研究方法:
　　 (1)建模及分組
　　 按照第一章方法建立移植組(X,n=6)、創(chuàng)傷組(T,n=6)和正常組(N,n=3)動(dòng)物模型。
　　 (2)取材及樣本制備
　　 分別于術(shù)后D7、D30處死X組及T組大鼠,每組3只；N組3只大鼠在購(gòu)買(mǎi)當(dāng)天即處死。去皮后取下整個(gè)頰黏膜,液氮凍存?zhèn)溆谩?br>　　 (3)芯片檢測(cè)用樣本的制備
　　 Trizol法

22、提取組織總RNA,去除DNA并純化,質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
　　 (4)PCR芯片檢測(cè)與結(jié)果分析
　　 完成大鼠炎癥性細(xì)胞因子趨化因子PCR芯片(美國(guó)SABiosciences公司)的熒光定量PCR反應(yīng)。采用ΔΔCt方法計(jì)算靶基因的相對(duì)含量(β-actin為內(nèi)參)及倍數(shù)變化值；差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn):從計(jì)算結(jié)果中篩選出該基因在X組中表達(dá)水平比N組上調(diào)2倍或下調(diào)2倍以上的基因,并除去T組中同樣也升高的基因。
　　

23、 3.結(jié)果:
　　 X-D7組:17種基因表達(dá)上調(diào),其中趨化因子家族10個(gè)(CCL12、CCL17、CCL22、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CXL1、CXCL2、XCR1),與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的募集有關(guān)；細(xì)胞因子家族7個(gè)(IL-10、IL-11、IL—1Rb、IL-3、IL-4、Lta、Spp1),分別屬于Th1型、Th2型細(xì)胞因子及集落刺激因子家族,涉及調(diào)控感染、炎癥及移植免疫反應(yīng)等。

24、r>　　 X-D30組:僅有CCL24、IL-1f6表達(dá)上調(diào),前者主要與靜止的T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的募集有關(guān)；后者是IL-1家族新發(fā)現(xiàn)的成員,介導(dǎo)炎癥信號(hào)通路NF-kappaB和MAPKsIL-1的活化。
　　 4.結(jié)論:
　　 差異表達(dá)的趨化因子基因與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的募集有關(guān)；Th1細(xì)胞因子型、Th2細(xì)胞因子及其它炎癥細(xì)胞因子參與了口腔黏膜移植免疫。因此推測(cè)口腔黏膜移植后的炎癥反應(yīng)是天然免

25、疫與適應(yīng)性免疫、促炎因素與抑炎因素協(xié)同作用的免疫病理過(guò)程,上述作用的失衡可能是導(dǎo)致移植物損害加劇的主要因?yàn)椤?br>　　 第四章 CINC-1-CXCR2軸在大鼠口腔黏膜移植中的作用研究
　　 1.研究目的:
　　 分別從mRNA及蛋白水平比較口腔黏膜移植早、晚期中性粒細(xì)胞主要的趨化因子CINC-1-CXCR2軸表達(dá)的變化,以探明其表達(dá)規(guī)律與炎癥反應(yīng)間的關(guān)系；進(jìn)行移植早期MPO與CINC-1和CXCR2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

26、分析,以明確該軸在移植早期對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用；Fk506干預(yù)實(shí)驗(yàn)用于證實(shí)CINC-1-CXCR2軸在移植早期炎癥反應(yīng)中所起的作用。
　　 2.研究方法:
　　 (1)建模及分組
　　 按照第一章方法建立移植組(X,n=12)、創(chuàng)傷組(T,n=12)和正常組(N,n=4)動(dòng)物模型。
　　 (2)熒光定量PCR及蛋白檢測(cè)用樣本的制備
　　 分別于術(shù)后D7、D30處死X組及T組大鼠,每組6只；N組4

27、只大鼠在購(gòu)買(mǎi)當(dāng)天即處死。去皮后取下整個(gè)頰黏膜,液氮凍存?zhèn)溆?。Trizol法提取組織總RNA,質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,凍存?zhèn)溆谩?br>　　 蛋白檢測(cè)樣本使用第二章中提取并分裝的組織蛋白樣本,與MPO檢測(cè)所用樣本來(lái)自相同的個(gè)體。
　　 (3)熒光定量RT-PCR檢測(cè)CINC-1、CXCR2的基因含量(以β-actin為內(nèi)參)。
　　 (4)ELISA法檢測(cè)各組D7、D30口腔黏膜和/或頜下淋巴結(jié)中CINC-1、CXC

28、R2蛋白水平。
　　 (5)未經(jīng)Fk506處理的D7各組MPO與CINC-1或CXCR2蛋白的Pearson相關(guān)性分析(2-tailed)。
　　 3.結(jié)果:
　　 X-D7組:CINC-1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平顯著高于正常組、T-D7組、X-D30組(P值均<0.05)；CXCR2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平水平也高于正常組(P值分別為0.038、0.042)。
　　 X-D30組:CINC-1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平與T

29、-D30組及正常組均無(wú)顯著差別；CXCR2基因水平與T-D30組及N組無(wú)明顯差異,但其蛋白水平卻顯著高于T-D30組及N-D30組(P值分別為0.002、0.001)。
　　 FX-D7組:CINC-1、CXCR2蛋白水平在口腔黏膜的表達(dá)較X-D7組顯著降低(P值分別為0.001,0.046),但仍顯著高于FN-D7組(P值分別為0.001,0.018)。CINC-1的蛋白水平還顯著高于FT-D7組(P<0.001),而CXCR

30、2表達(dá)卻與FT-D7組卻無(wú)明顯差別。此外,數(shù)據(jù)顯示CINC-1、CXCR2蛋白在SMLN的表達(dá)與其它各組均無(wú)明顯差別。
　　 相關(guān)分析表明,MPO與CINC-1或CXCR的蛋白表達(dá)僅在X-D7組具有顯著的正相關(guān)性。
　　 4.結(jié)論:
　　 本研究結(jié)果提示:CINC-1-CXCR2軸,作為中性粒細(xì)胞主要的趨化因子在口腔黏膜移植早期與中性粒細(xì)胞的募集關(guān)系密切；該生物軸可能通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞促進(jìn)了口腔黏膜移植后的炎癥反