雙標(biāo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞治療頸總動脈創(chuàng)傷的MRI活體示蹤研究.pdf

1、以不同方法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，應(yīng)用超順磁性氧化鐵(SPIO，Superparamagnetic iron oxide)即Fe203-多聚左旋賴氨酸(PLL)的偶聯(lián)物及羰花青熒光染料(DiI 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’，3’-tetramethylindo-Carbocyanine perchlorate)標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，構(gòu)建BMSCs-

2、SPIO-DiI生物探針，同種異體移植治療大鼠頸總動脈創(chuàng)傷，應(yīng)用7Tmicro-MR儀進行活體成像，為干細胞移植并活體無創(chuàng)示蹤提供實驗依據(jù)。
　　 無菌條件下分離大鼠雙下肢，低糖DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓，分別運用全骨髓貼壁法和密度梯度離心法體外分離骨髓間充質(zhì)干細胞，利用差速貼壁原理對細胞進行純化擴增，在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細胞的形態(tài)變化，體外培養(yǎng)、傳代、擴增。制備Fe203-PLL，對分離純化并傳代培養(yǎng)的大鼠BMSCs標(biāo)記Fe

3、203-PLL，細胞移植前，羰花青熒光染料標(biāo)記，構(gòu)建BMSCs-SPIO-DiI生物探針。普魯士藍染色顯示細胞內(nèi)鐵，熒光顯微鏡顯示紅色熒光，胎盼藍拒染法檢測細胞活率，觀察標(biāo)記前后細胞的生長狀況。12只急性頸總動脈創(chuàng)傷大鼠模型分成實驗和對照兩組，將標(biāo)記細胞（實驗組，n=6）和未標(biāo)記細胞（對照組，n=6）同種異體經(jīng)過尾靜脈移植入大鼠體內(nèi)，在移植前、移植后3h及3、7、12d應(yīng)用MR的PD-T2及3D-FLASH序列對大鼠頸總動脈進行活體成像

4、，測量創(chuàng)傷處管壁信噪比（signal-to-noise ratio，SNR)，并與相應(yīng)頸總動脈組織切片普魯士藍染色及熒光顯像對照。
　　 與密度梯度離心法相比，全骨髓貼壁法分離獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁時間短，增殖快，經(jīng)傳代后能夠純化。原代培養(yǎng)8～10d后可分離得到骨髓間質(zhì)干細胞，且骨髓充間質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)生長狀況良好，呈均一的成纖維細胞樣，傳代周期為3-4d。BMSCs-SPIO-DiI標(biāo)記率近100％，普魯士藍染色及電鏡顯示

5、藍色鐵顆粒位于MSCs胞質(zhì)內(nèi)，熒光顯微鏡下胞漿內(nèi)示紅色熒光。標(biāo)記對細胞活率及生長狀況無明顯影響。實驗組和對照組移植前、移植后3h及3、7、12d創(chuàng)傷頸動脈的SNR分別為14.52±2.14，13.47±1.13,4.22±2.16，5.51±2.15，12.90±1.56;14.31±3.12,15.12±2.23,14.10±1.79,14.63±3.47,14.17±2.82。與注射前比較，實驗組3、7d創(chuàng)傷頸總動脈的SNR下降，差

6、異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Dunnett檢驗，t值分別為10.03,8.01,P值均<0.05)，3h及12d時SNR雖仍較低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Dunnett檢驗，t值分別為1.09，1.25，P>0.05)。對照組移植后各時間點與移植前比較，SNR改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(方差分析，F(xiàn)= 0.139，P>0.05)。組織學(xué)示紅色熒光及普魯士藍陽性細胞主要分布于頸總動脈創(chuàng)傷周圍病變區(qū)。
　　 采用全骨髓貼壁法可穩(wěn)定獲得均質(zhì)性良好的大鼠骨