活體示蹤GFP、SPIO標記的骨髓間充質(zhì)干細胞治療骨缺損的研究.pdf

1、目的:骨缺損的治療一直是研究的熱點，以往使用自體骨、異體骨、人工骨替代品等，然而大的骨缺損其利用率有限并受許多條件限制。隨著組織工程學的發(fā)展，組織工程骨備受青睞，而種子細胞是組織工程骨的首要條件，以骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)尤為突出，因其低的免疫原性和不受倫理學的限制，且具有能在需要成骨的地方分化為成骨細胞的能力，所以成為近來研究的焦點。然而需要采用一種

2、非侵襲性方法對標記的干細胞進行活體示蹤，更好的了解干細胞在體內(nèi)的生存、遷徙、分化等。常用的活體示蹤方法有可見光成像、核磁共振、放射性核素成像等。
　　本研究使用綠色熒光蛋白(Green fluoreseent protein，GFP)、超順磁性氧化鐵（Superparamagnetic iron oxide，SPIO）雙重標記骨髓間充質(zhì)干細胞，并在體外培養(yǎng)，接種于羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)支架，移植到SD大鼠

3、顱骨缺損模型中，并用小動物可見光成像對移植的干細胞進行熒光成像，最后用免疫組化的方法進一步證實干細胞的轉(zhuǎn)歸，同時也彌補了單一SPIO標記易出現(xiàn)假陽性的可能，為骨缺損的治療提供了依據(jù)。
　　研究方法:本實驗對GFP、SPIO標記的骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)，接種于HA支架，并在特定時間點2d、4w、8w、12w對細胞-支架共培養(yǎng)的復(fù)合物進行熒光檢測。SD大鼠分成兩組，細胞接種HA支架組10只、細胞未接種組10只，將細胞接種的HA支

4、架體外培養(yǎng)1w后移植到SD大鼠顱骨缺損模型中，隨后用小動物可見光成像對其進行熒光檢測。在4w、8w、12w用小動物可見光成像分別對兩組大鼠進行X線拍照，在X線片上進行骨密度測量，做出統(tǒng)計。12w后取材，使用免疫組化、普魯士藍、蘇木精-伊紅(Hemotoxylin-Eosin，HE)方法對組織切片進行觀察。
　　結(jié)果:體外條件下，干細胞與HA支架結(jié)合良好，到達12w時間點，熒光顯微鏡觀察顯示，支架上仍然有大量的干細胞存在，且干細胞顯

5、示出很強的綠色熒光。體內(nèi)條件下，小動物可見光成像顯示，在移植后的第二天，可以觀察到微弱的綠色熒光，之后的時間點熒光信號消失。骨密度測量顯示，差異有統(tǒng)計學意義，接種細胞組好于未接種細胞組。免疫組化觀察顯示，移植的干細胞最終分化為成骨細胞，普魯士藍染色法觀察到組織上有被染成藍色的SPIO顆粒，HE染色顯示出接種細胞組有大量的新骨生成。
　　結(jié)論:免疫組化的結(jié)果顯示移植的干細胞最終分化為成骨細胞，且細胞接種支架組有大量的新骨生成，證實了