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文檔簡介
1、目的:喉癌是危害人類健康和生命的惡性腫瘤,手術(shù)及放療為其主要治療手段,但手術(shù)后患者喉失去原有的發(fā)音功能,很大程度影響喉癌病人的生活質(zhì)量及生存率。近年來隨著化療水平的提高,化療在喉癌的綜合治療中越來越占有重要的地位,比如喉癌的新輔助化療,其目的在于縮小腫瘤、使臨床分期提前、與放療或喉部分切除術(shù)結(jié)合盡可能保留喉的發(fā)音功能。喉癌因位置隱蔽,發(fā)現(xiàn)時往往已到中晚期,晚期喉癌或經(jīng)手術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者再次手術(shù)較為困難,單純放療只針對局部病灶,難以收到
2、理想的效果,臨床上即給予化療,以控制腫瘤的全身轉(zhuǎn)移,緩解癥狀,延長生命。 鉑類是頭頸部化療的基礎(chǔ)用藥,以順鉑(cDDP)為基礎(chǔ)的化療在頭頸部腫瘤治療中研究較多,并取得了一定的療效,由于順鉑嚴(yán)重的腎毒性和消化道副作用限制了它在臨床的應(yīng)用,因此開發(fā)高效低毒的鉑類制劑一直是學(xué)者們研究的方向。洛鉑是第三代鉑類衍生物,洛鉑以其較輕的毒副作用、與順鉑不完全交叉耐藥以及較強(qiáng)的抗腫瘤活性,已初步顯示了其在腫瘤治療中的重要作用。 本實(shí)驗(yàn)以
3、喉癌細(xì)胞株Hep-2為模型,采用倒置顯微鏡、MTT比色法、流式細(xì)胞技術(shù)檢測洛鉑對喉癌細(xì)胞的增殖、周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2的表達(dá),初步探討洛鉑對喉癌細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞周期改變、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等方面的作用,為洛鉑在頭頸部腫瘤化療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1以對數(shù)生長期的喉癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將實(shí)驗(yàn)分組為:①空白對照組(培養(yǎng)液);②陰性對照組(細(xì)胞+培養(yǎng)液)
4、;③實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞+不同濃度洛鉑+培養(yǎng)液);將各組分別培養(yǎng)24、48、72小時。 2倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 3應(yīng)用MTT比色法檢測洛鉑對喉癌細(xì)胞的增殖抑制情況。 4應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的改變。 5應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法(S-P法)檢測bcl-2蛋白表達(dá)的變化。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)分析時先行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布計(jì)量
5、資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),符合方差齊性后采用單因素方差分析的方法進(jìn)行,如差異有顯著性,進(jìn)一步LSD法進(jìn)行兩兩比較。兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn),顯著性水平以p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1相差顯微鏡下每日觀察對照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞大小和形態(tài)的變化。陰性對照組Hep-2細(xì)胞為上皮樣,貼壁生長于培養(yǎng)基質(zhì),輪廓清晰,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密,生長旺盛。5μmol/L洛鉑作用48h后可見少量細(xì)胞體積增
6、大、變圓,仍貼壁生長。20μmol/L時貼壁生長細(xì)胞逐漸減少,變圓細(xì)胞逐漸增多,脫壁漂浮的小圓球細(xì)胞及細(xì)胞碎片逐漸增多,到80μmol/L高濃度藥物作用后貼壁生長細(xì)胞極少,出現(xiàn)成堆漂浮的死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片。 2洛鉑對細(xì)胞增殖的影響:不同濃度洛鉑在同一時間A值與對照組比較,5μmol/L洛鉑作用24小時與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。同一濃度洛鉑作用24、48、72小時比較差異均有統(tǒng)計(jì)
7、學(xué)意義(p<0.05)。洛鉑能明顯抑制喉癌細(xì)胞的增殖,抑制率隨著藥物濃度的增加而增加,有劑量依賴關(guān)系;抑制率并隨著藥物作用時間的延長而增加,有時間依賴關(guān)系。但是到達(dá)一定抑制率(80%左右)后,再增加洛鉑藥物濃度,抑制率增加并不明顯,呈現(xiàn)平臺效應(yīng)。 3.洛鉑對細(xì)胞周期的影響:同一濃度洛鉑作用24、48、72小時S期及G0/G1期與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。5μmol/L洛鉑作用24小時開始引起喉癌細(xì)胞S期比例增
8、加,隨著作用時間延長到72小時時S期細(xì)胞比例下降,G0/G1期細(xì)胞比例增加。20μmol/L洛鉑作用24小時使細(xì)胞阻滯在S期,阻滯作用明顯,隨著作用時間延長,S期細(xì)胞比例下降,隨后出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,表明低濃度短時間內(nèi)使喉癌細(xì)胞阻滯在S期,高濃度長時間可使喉癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。 4 洛鉑對細(xì)胞凋亡率的影響:正常對照組細(xì)胞無凋亡峰出現(xiàn),5μmol/L洛鉑作用24小時后有小的凋亡峰出現(xiàn),作用48、72小時后出現(xiàn)明顯的凋
9、亡峰,20μmol/L作用24、48小時均出現(xiàn)明顯的凋亡峰。不同濃度洛鉑作用于喉癌細(xì)胞24、48、72小時的凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),同一濃度洛鉑對喉癌細(xì)胞作用24小時、48小時凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。結(jié)果表明洛鉑可以誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡,而且隨著藥物濃度和作用時間的增加,凋亡率逐漸增加,洛鉑誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞的凋亡呈時間和劑量依賴關(guān)系,低劑量洛鉑(5μmol/L)24小時即可誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。 5 應(yīng)
10、用免疫細(xì)胞化學(xué)法(S-P法)檢測各組細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)的變化;20μmol/L洛鉑作用48小時后,bcl-2表達(dá)減弱,經(jīng)t檢驗(yàn)p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1洛鉑在體外具有抑制喉癌細(xì)胞增殖的作用,呈時間和劑量依賴性。 2.洛鉑可以對喉癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯,低濃度短時間阻滯在S期,高濃度長時間可產(chǎn)生G0/G1期阻滯。 3.洛鉑能誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,呈時間和劑量依賴性,5μmol/L濃度洛
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