靶向VEGF的siRNA表達框架（SECs）抑制人喉鱗狀細胞癌細胞株（Hep-2）生長的實驗研究.pdf

1、第一部分VEGF在人喉鱗狀細胞癌細胞(Hep-2)中的表達及意義 目的:檢測人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)中是否有VEGF基因的表達以及表達的水平，為后續(xù)的研究奠定基礎。 方法:應用RT-PCR方法檢測人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)中VEGF基因的mRNA的表達；Hep-2細胞的總RNA使用Trizol提取，逆轉錄反應使用OligodT，每個反應使用等量的RNA(5μ1)，VEGF引物由武漢伯杰生物技術有限公司合

2、成，上游引物：5'CAGCCCCAGCTACCACCTC3'；下游引物：5'TCTTCCTCCTCCCCCTCCTC3'，VEGFcDNA中的擴增產物大小約268bp。內參照選擇β-actin，上游引物：5'GCACTCTTCCAGCCTTCCTTC3'，下游引物：5'CTGTCACCTTCACCGTTCCA3'，Tm62度，擴增產物大小約508bp。電泳檢測PCR產物，在紫外燈下觀察結果，與Marker(DL2000)對比分子量，采用

3、quantiscan軟件對電泳圖像掃描分析并計算VEGF與β-actin吸光度(A)。 結果:應用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)中VEGF基因有很強的表達，表明VEGF在人喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、生長和轉移過程中起到重要的作用。 結論: 1.RT-PCR方法檢測提示人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)中VEGF的mRNA有很強的表達。 2.VEGF基因可能在人喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、生長

4、和轉移過程中起到至關重要的作用。 第二部分使用siRNA表達框架的方法對靶向VEGF特異性設計的siRNA序列進行篩選 目的：設計合成特異性干擾人VEGF基因的siRNA序列。 方法：在Genebank人K-ras基因組全序列中，篩選符合合成siRNA序列要求的序列，用BLAST工具排除同源序列；從這些序列中篩選符合siRNA表達框架法設計要求的序列作為其PCR擴增的特異性下游引物。 結果：按照以上要求

5、我們挑選了四個siRNA序列，這四個序列分別位于第1130位點、1498位點、1366位點和1492位點。1130位點的正義引物序列為5'AAGGAGGAGGGCAGAATCATC3'1130位點的反義引物序列為5'AAGATGATTCTGCCCTCCTCC3'1498位點正義引物序列為5'AAGCGCAAGAAATCCCGGTAT3'1498位點的反義引物序列為5'AAATACCGGGATTTCTTGCGC3'1366位點正義引物序列

6、為5'AAACCTCACCAAGGCCAGCAC3'1366位點的反義引物序列為5'AAGTGCTGGCCTTGGTGAGGT3'1492位點正義引物序列為5'AAACGAAAGCGCAAGAAATCC3'1492位點的反義引物序列為5'AAGGATTTCTTGCGCTTTCGT3'陰性對照正義引物序列為5'AAACGAACAGGCAAGAAATCC3'陰性對照反義引物序列為5'AAGGATTTCTTGCCTGTTCGT3' 結

7、論：我們在人VEGF基因組全序列中找到了符合siRNA表達框架法設計要求的四個siRNA序列并設計了陰性對照。 第三部分使用siRNA表達框架的方法進行擴增的PCR產物在人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)中的轉染 目的：應用siRNA表達框架法擴增PCR產物并將擴增的產物轉染入人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)。 方法：以實驗第二部分篩選的siRNA序列作為下游引物，用PCR擴增的DNA產物構建不同位點的siR

8、NA表達框架，產物純化后利用脂質體轉染入Hep-2細胞，轉染48小時后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。 結果： 1.PCR擴增出正確的DNA產物；2.轉染后48小時后倒置顯微鏡下觀察可見1366位點干擾的細胞組生長速度明顯減慢，細胞可見皺縮、變圓并開始脫落；而其他三個位點的細胞形態(tài)學上未見明顯的改變，生長速度和形態(tài)與正常細胞的生長狀態(tài)相比沒有明顯的區(qū)別；陰性對照細胞和空轉細胞的生長速度都正常，形態(tài)完整、飽滿，未表現(xiàn)出凋

9、亡形態(tài)。 結論： 1.siRNA表達框架中PCR擴增的DNA產物純化后在電泳圖上位于正確的位置； 2.帶有1366位點siRNA序列的DNA片斷轉染入細胞后，細胞生長和形態(tài)發(fā)生特異性變化；而帶有其他位點siRNA序列的DNA片斷轉染入細胞后，細胞生長和形態(tài)無明顯改變。 第四部分轉染后的人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)VEGF表達的檢測及其凋亡的檢測 目的：從功能和蛋白水平來檢測和評價靶向VEG

10、F基因的siRNA表達框架轉染喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)后對其生長的影響以及VEGF基因被封閉的情況；探討RNA干擾技術抑制人喉鱗狀細胞癌細胞生長的效果以及作為腫瘤基因治療工具的應用前景。 方法：應用流式細胞儀檢測人喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2在siRNA干擾下凋亡細胞的變化，應用RT-PCR、免疫熒光、Westernblot法分別檢測VEGF基因在被siRNA干擾下mRNA和蛋白表達水平的改變。 結果：對照組細胞生

11、長正常，轉染1366位點的siRNA片段實驗組的凋亡細胞數(shù)明顯增多，VEGF基因的mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯減弱；而轉染入其它三個位點siRNA片段的細胞凋亡數(shù)與對照組無明顯差別，檢測VEGF基因的mRNA和蛋白水平較對照組無明顯差別。 結論：針對VEGF基因標準序列設計的四段siRNA表達框架中，1366位點的siRNA片段能強有效地抑制VEGF基因的復制和表達，幾乎能達到“基因敲除”的效果，從而抑制人喉鱗狀細胞癌細胞