低氧對人喉癌Hep-2細胞c-met蛋白表達及細胞殖的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:肝細胞生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,c-met)對細胞增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和浸潤運動等均有調節(jié)作用,與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本實驗通過模擬人體實體腫瘤低氧環(huán)境,檢測人喉鱗癌細胞系Hep-2細胞的增殖、凋亡以及c-met、HIF-1α(hypoxia-inducible factorl,HIF-1)蛋白表達,旨在探討低氧對喉癌Hep-2細胞c-met蛋白表達及細胞增殖的

2、影響,從而為腫瘤的發(fā)生機制及抗腫瘤靶向治療提供理論依據與實驗基礎。
   方法:
   1.細胞培養(yǎng)環(huán)境處理:低氧培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、2%O2、93%N2、飽和濕度,對照常氧培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2、20%O2、75%N2、飽和濕度。
   2.免疫細胞化學鑒定人喉癌Hep-2細胞表面c-met蛋白的表達。
   3.流式細胞檢測喉鱗狀細胞系Hep-2低氧以及常氧6h、12h、24h、36h

3、 c-met、HIF-1α蛋白的表達情況及細胞凋亡率的變化。
   4.應用MTT法檢測低氧組與常氧組6h、12h、24h、36h細胞增殖率的不同,加入40ng/ml HGF組與不加HGF組6h、12h、24h、36h細胞增殖率的不同。
   結果:
   1.通過免疫細胞化學方法檢測,與陰性對照組相比,實驗組細胞膜上可見黃褐色顆粒,為c-met蛋白顯色,證明人喉鱗癌細胞系Hep-2細胞表面有c-met蛋白表達。

4、
   2.應用流式細胞儀檢測常氧6h、12h、24h、36h c-met蛋白FI分別為:1.062±0.087、1.057±0.034、1.082±0.018、1.111±0.056;低氧6h、12h、24h、36h c-met蛋白FI分別為:1.079±0.042、1.088±0.036、1.167±0.058、1.109±0.029;常氧6h、12h、24h、36h HIF-1α蛋白FI分別為:1.002±0.027、1.

5、119±0.021、1.140±0.030、1.161±0.065;低氧6h、12h、24h、36h HIF-1α蛋白F1分別為:1.163±0.072、1.214±0.011、1.268±0.011、1.149±0.085。HIF-1α與c-met蛋白表達均在低氧6h、12h、24h逐漸升高,24h為高峰,24h至36h逐漸下降;兩個蛋白在常氧環(huán)境下表達穩(wěn)定,無時間依賴性;HIF-1α于低氧6h、12h、24h、36h蛋白表達均比常氧

6、明顯增強,c-met于12h、24h蛋白表達比常氧增強。說明低氧可促進HIF-lα與c-met蛋白表達。HIF-1α與c-met蛋白在低氧6h、12h、24h呈正相關(r=0.710,p<0.05),且HIF-1α的表達優(yōu)先于c-met,說明c-met受HIF-1α的調節(jié)。
   3.常氧與低氧細胞增殖率均呈逐漸升高趨勢,無HGF的常氧組與低氧組6h、12h、24h、36h各時間點下比較于24h有顯著差別(p<0.01),6h、

7、12h、36h無差異;常氧條件下各時間點組之間兩兩比較均有顯著差異(p<0.01),低氧條件下各時間點組之間兩兩比較也均有顯著差異(p<0.01)。細胞增殖率與HIF-1α蛋白于低氧6h、12h、24h呈明顯正相關(r=0.811,p<0.01)。表明低氧可促進細胞增殖,且細胞增殖率可隨時間延長逐漸增高。
   4.常氧HGF(40ug/L)組及低氧HGF(40ug/L)組細胞增殖率均隨時間延長逐漸升高。常氧條件下,無HGF組與

8、HGF40ug/L組于12h有差異(p<0.05),24h有顯著差異(p<0.01);低氧條件下,無HGF組與HGF40ug/L組于24h有顯著差異(p<0.05)。細胞增殖率與HIF-1α蛋白于低氧6h、12h、24h呈正相關(r=0.682,p<0.05)。說明HGF/c-met可促進細胞增殖,且細胞增殖率可隨時間延長逐漸增高。
   5.常氧條件下,6h、12h、24h、36h各時間點之間細胞凋亡率無明顯差別(p>0.05

9、);低氧條件下,6h、12h、24h之間兩兩比較無明顯差別,36h與6h、12h、24h之間有差別,于36h凋亡率有升高趨勢;常氧6h、12h、24h凋亡率與低氧6h、12h、24h相比統(tǒng)計學差異顯著(p<0.01),低氧細胞凋亡率于6h、12h、24h較常氧狀態(tài)下低,常氧36h凋亡率與低氧36h相比有統(tǒng)計學差異(p<0.05),低氧細胞凋亡率于36h較常氧狀態(tài)下高。表明低氧能夠抑制細胞凋亡,但在一定的條件下還可以促進細胞凋亡。

10、   結論:
   1.人喉鱗癌細胞系Hep-2細胞表面確實有c-met蛋白的大量表達。
   2.體外實驗控制細胞低氧生存環(huán)境,低氧可以促進腫瘤細胞HIF-1α及c-met蛋白的表達,常氧環(huán)境下兩種蛋白表達相對穩(wěn)定,并且低氧可能通過提高HIF-1α基因轉錄水平的表達而調節(jié)c-met基因的表達,c-met蛋白表達水平隨HIF-1α升高而升高,二者呈正相關,但HIF-1α的表達優(yōu)先于c-met,隨著時間的延長,后期細胞長

11、期持續(xù)缺氧出現兩種蛋白表達的下降。
   3.1氐氧條件下細胞的增殖率較常氧明顯升高,HIF-1α于低氧下表達活躍,且低氧下細胞增殖率隨HIF-1α蛋白表達的增加而升高,說明低氧能夠促進人喉鱗癌細胞系Hep-2增殖,且在此促進過程中HIF-1α起到了重要作用。
   4.通過外來給予HGF干預,刺激Hep-2細胞表達c-met蛋白增加,發(fā)現無論在常氧環(huán)境還是低氧環(huán)境下加入HGF的細胞增殖率都有升高,說明HGF/c-met

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