喉癌Hep-2細(xì)胞來源exosomes的提取、鑒定及提取方法比較.pdf

1、1喉癌 Hep-2細(xì)胞來源的 exosomes的發(fā)現(xiàn)和提取
　　目的：觀察喉癌 Hep-2細(xì)胞可否分泌 exosomes，并從形態(tài)學(xué)角度鑒定。
　　方法：大量培養(yǎng)喉癌 Hep-2細(xì)胞，42℃熱休克處理，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，先通過3/0.8μm深層過濾小型濾芯對(duì)上清進(jìn)行預(yù)處理，去除直徑較大的顆粒和雜質(zhì)。采用Exosome Isolation Kit（商品化試劑盒）：收集4ml已經(jīng)預(yù)處理的濾過液，依次加入 Exosome Iso

2、lation Kit內(nèi)試劑，通過 exosomes提取專用過濾柱，收集濃縮液。用高倍透射電子顯微鏡對(duì) exosomes濃縮液鑒定。
　　結(jié)果：成功地從喉癌 Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離提取出 exosomes，電鏡觀察見exosomes呈圓形或橢圓形雙層膜的囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑約20-100nm，密度較高，分散均勻。
　　結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)喉癌細(xì)胞自身能分泌 exosomes，為喉癌免疫治療做新的探求。
　　2喉癌 Hep-2

3、細(xì)胞來源的 exosomes提取方法的比較
　　目的：對(duì)分離提取喉癌 Hep-2細(xì)胞來源的 exosomes兩種方法對(duì)比，展現(xiàn)不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為選擇分離提取包括喉癌 Hep-2細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞來源 exosomes的方法，提供參考。
　　方法：大量培養(yǎng)喉癌 Hep-2細(xì)胞，42℃熱休克處理。蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾離心法：收集90ml培養(yǎng)上清液，先通過3/0.8μm深層過濾小型濾芯對(duì)上清進(jìn)行預(yù)處理，去除直徑較大的顆粒和雜

4、質(zhì)，再利用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾離心法，將上清液濃縮提純；Exosome Isolation Kit（商品化試劑盒）：收集培養(yǎng)上清液4ml，依次加入 Exosome Isolation Kit內(nèi)試劑，通過 exosomes提取專用過濾柱，收集濃縮液。用高倍透射電子顯微鏡對(duì)兩法所得的 exosomes濃縮液分別鑒定，作出評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：兩法均能成功地從喉癌 Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離提取出 exosomes。單個(gè)高倍視野下，蔗

5、糖密度梯度離心聯(lián)合超濾離心法提取 exosomes分散性較好，但密度較低，背景見雜質(zhì)較多；Exosome Isolation Kit所提取 exosomes排列緊密，密度較高，背景雜質(zhì)較少。
　　結(jié)論：兩種方法各具特點(diǎn)，均是較理想的 exosomes分離提取方法。利用Exosome Isolation Kit分離提取 exosomes具有樣本量少、提取時(shí)間短、步驟簡單、產(chǎn)物量大等優(yōu)點(diǎn)，為喉癌 Hep-2來源 exosomes的分離