硼替佐米對骨髓瘤患者破骨細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤的突出臨床特點之一是骨質(zhì)破壞,這種進(jìn)行性的骨質(zhì)破壞在臨床上表現(xiàn)為骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、彌漫性骨質(zhì)疏松等,從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。約有85％以上的多發(fā)性骨髓瘤患者會出現(xiàn)骨質(zhì)破壞,這也是患者最常見的死亡原因。 骨髓瘤骨質(zhì)破壞的主要原因是破骨細(xì)胞大量生成和激活。已有資料表明,在患者骨破壞區(qū)成骨細(xì)胞活性下降,而破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多且功能活躍,導(dǎo)致新骨形成減少或消失,骨的再吸收增加而發(fā)生溶骨病變。正常情況下,骨

2、質(zhì)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定主要通過RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)來實現(xiàn)。破骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞表面表達(dá)核因子κB受體激活劑(RANK),RANK與可溶性的或成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞表面的RANKL結(jié)合,通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑,促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟和骨吸收功能。骨保護(hù)素(OPG)以一種誘餌受體的形式,與RANKL結(jié)合,競爭性地阻斷了RANKL和RANK之間的聯(lián)系,起到平衡骨質(zhì)內(nèi)環(huán)境的作用。 在骨髓瘤患者體內(nèi),骨髓瘤細(xì)胞本身表達(dá)RANKL增加,或通

3、過與周圍基質(zhì)細(xì)胞的相互作用,促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的RANKL的表達(dá),同時削弱骨質(zhì)微環(huán)境中OPG的作用；另外IL-1β、PTHγ、MIP-1α等細(xì)胞因子直接或間接刺激破骨細(xì)胞,增加破骨細(xì)胞的活性,引起溶骨性病變。破骨細(xì)胞表面的RANK通過下游連接蛋白來激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,研究表明腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6(TRAF6)與RANK結(jié)合的位點比較獨特,TRAF6基因敲除的小鼠表現(xiàn)為破骨細(xì)胞分化障礙和破骨細(xì)胞活性喪失,說明TRAF6是RANK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

4、中必需的上游效應(yīng)器。RANKL的信號經(jīng)RANK傳遞給TRAF6,再經(jīng)TRAF6激活下游NF-κB通路、MAPK通路、P13K/Akt恿路和CN/NFAT等通路,引起破骨細(xì)胞的一系列生物學(xué)反應(yīng)。 除RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)外,破骨細(xì)胞受到內(nèi)環(huán)境中很多因子和刺激因素的影響。近來一項值得注意的研究表明,將蛋白酶體抑制劑MG-132和MG-262直接作用于外周血單個核細(xì)胞來源的破骨樣細(xì)胞,可以觀察到破骨細(xì)胞分化受抑,骨吸收功能明

5、顯下降,并以劑量依賴的方式減弱耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性,也減弱了TRAF6下游信號傳導(dǎo)因子NF-κB的活性。并由此可以推斷,某些蛋白酶體抑制劑不僅可用于治惡性疾病本身,而且可在一定程度上直接改善腫瘤相關(guān)性骨病的預(yù)后。 近年來,在多發(fā)性骨髓瘤的治療方面涌現(xiàn)出一批新的靶向藥物,其中蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,商品名Velcade)具有全新的和獨特的作用機(jī)制,被美國FDA批準(zhǔn)用于復(fù)治性和難治性骨髓瘤的治療。

6、在真核生物體內(nèi),細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解主要通過泛素-蛋白酶體通路。而硼替佐米通過抑制蛋白酶體20S亞單位的活性,從而穩(wěn)定NF-κB的抑制劑IκB,阻止NF-κB的核易位,抑制NF-κB的活性,導(dǎo)致細(xì)胞抗凋亡蛋白水平降低,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時通過選擇性抑制一些特異的蛋白降解,包括細(xì)胞周期依賴的激酶抑制劑和抑癌蛋白(如cyclin E、p21waft/Cip1、p27、p53)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由于硼替佐米的作用,必然使得骨髓瘤細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)

7、生改變,從而間接影響到破骨細(xì)胞的分化成熟和功能。然而,聯(lián)系到上述醛酞類蛋白媒體抑制劑對于破骨細(xì)胞的作用,我們感興趣的是：硼替佐米是否能直接影響到破骨細(xì)胞的分化與功能,如果能,其中可能的機(jī)制又是如何? 因此,本課題擬使用蛋白酶體抑制劑硼替佐米直接作用于骨髓瘤骨病患者的破骨細(xì)胞,觀察該藥物對于破骨細(xì)胞的直接作用,并且進(jìn)一步觀察藥物對TRAF6水平及其泛素化后降解的影響,從而發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤治療中萬珂在骨病方面可能的新的作用,并且初步探討蛋

8、白酶體抑制劑在破骨細(xì)胞中的作用靶點和作用機(jī)制。研究包括以下三個部分： 第一部分 從外周血誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得破骨細(xì)胞的研究 從正常人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)著手,建立獲得高產(chǎn)量高純度破骨細(xì)胞的方法,為骨腫瘤患者破骨細(xì)胞的體外研究提供豐富的細(xì)胞來源。從人外周血分離單個核細(xì)胞貼壁培養(yǎng),采用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA聯(lián)合消化,純化后以RANKL和M-CSF加以誘導(dǎo)。 結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)方法相比,該方法可于每96孔板

9、中獲得1426±204個破骨細(xì)胞(P<0.05),0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA聯(lián)合消化可使破骨細(xì)胞純化率達(dá)90％。誘導(dǎo)生成的破骨細(xì)胞TRAP染色陽性,功能試驗顯示具有噬骨能力。 結(jié)論：該培養(yǎng)方法可產(chǎn)生大量的破骨樣細(xì)胞,方法簡便而且經(jīng)濟(jì)實用,可為破骨細(xì)胞的蛋白質(zhì)學(xué)研究及分子生物學(xué)研究提供豐富的細(xì)胞來源。 第二部分 硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤患者破骨細(xì)胞分化和功能的影響 觀察在多發(fā)性骨髓瘤患者破骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)

10、分化成熟過程中,硼替佐米對其分化和功能的影響。在患者外周血單個核細(xì)胞經(jīng)核因子κB受體活化因子配體(RANKL)及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化過程中,采用0.5nM、1nM、2.5nM、5nM硼替佐米進(jìn)行處理,14天觀察TRAP(+)破骨細(xì)胞數(shù)量,檢測各孔培養(yǎng)液中的耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性,28天后觀察骨片上骨陷窩的數(shù)量。 結(jié)果顯示,100倍光鏡下2.5nM、5nM硼替佐米組破骨細(xì)胞數(shù)量為157±

11、21和98±15個,較對照組(307±25)明顯減少(P<0.05),骨陷窩形成數(shù)量分別為對照組的53±24％和29±7％(P均<0.05),上清液中破骨細(xì)胞活性分別為對照組的86±24％和60±25％(P均<0.05)。 結(jié)論：硼替佐米可抑制骨髓瘤患者破骨細(xì)胞的分化和功能,可能成為骨髓瘤骨病治療的新方法。 第三部分 硼替佐米通過抑制TRAF6影響多發(fā)性骨髓瘤患者破骨細(xì)胞的生成 研究在硼替佐米作用下,破骨細(xì)胞分

12、化過程中上游的關(guān)鍵信號分子TRAF6的改變。在患者外周血單個核細(xì)胞經(jīng)RANKL及M-CSF誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化過程中,用小劑量硼替佐米進(jìn)行處理破骨前體細(xì)胞,采用western-blot、RT-PCR、IP法,分析硼替佐米對破骨前體細(xì)胞中TRAF-6蛋白、mRNA及TRAF-6泛素化水平的影響。 結(jié)果顯示,破骨前體細(xì)胞經(jīng)硼替佐米處理后觀察24小時,TRAF6蛋白活性逐漸降低,TRAF6的mRNA水平也有所下降,實驗中硼替佐米未能抑制