硼替佐米通過抑制NF-κB信號通路下調人骨髓瘤細胞系hCDC14A表達.pdf

1、背景和目的:利用FISH技術可在約20％～30％初治的多發(fā)性骨髓瘤(MM)中檢測出1號染色體短臂2區(qū)1帶的缺失(1p21)信號,且隨著疾病進展,1p21缺發(fā)生率及陽性率明顯增高,伴有1p21缺失的患者經大劑量化療,生存期無明顯延長,是獨立的不良預后因素。經過基因數據庫的篩選,我們發(fā)現(xiàn)hCDC14A基因參與中心體復制及細胞周期的調控。本課題組前期已經發(fā)現(xiàn)約40％的患者hCDC14AmRNA為低表達(結果尚未發(fā)表)?；诖?我們推測hCDC

2、14A有可能參與MM的發(fā)病,本實驗的目的在于進一步明確hCDC14A在MM中的作用及對于MM的一線治療藥物硼替佐米而言,該藥能否參與對hCDC14A的調控。
　　 方法:第一部分:采集29例MM患者(24例初治,4例復發(fā)/難治,1例移植后)骨髓標本,Ficoll法分離骨髓單個核細胞,經CD138磁珠分選后,采用RQ-PCR法檢測hCDC14A與p53基因mRNA的表達情況,并進行相關性分析。第二部分:1)采用Western-Bl

3、ot法檢測了我室保存的人骨髓瘤細胞系(HMCLs)表達hCDC14A蛋白；2)熒光共聚焦實驗檢測了hCDC14A蛋白在HMCLs中的表達和定位；3)給予不同濃度的硼替佐米(PS-341)(0、2.6nM、5.2nM、10.4nM)分別處理U266、OPM-2和MM1.S12h和24h,采用RQ-PCR法和Western-Blot法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測硼替佐米處理前后hCDC14A表達水平的變化；4)以2.6nM硼替佐米處理O

4、PM-2細胞0h、3h、6h、9h和12h；以不同濃度硼替佐米(0nM、1.3nM、2.6nM、3.9nM和5.2nM)處理OPM-2細胞6h,以上藥物分組處理后用Western-Blot法檢測hCDC14A、P53和磷酸化P53(S315)蛋白表達的變化；5)為證明硼替佐米對于hCDC14A的調控是通過抑制NF/κB信號通路而發(fā)揮作用,本實驗用EMSA法檢測了不同濃度硼替佐米(0nM、2.6nM和10.4nM)作于用OPM-2細胞6h

5、后,以及2.6nM硼替佐米處理OPM-2細胞6h和12h后,NF/κB活性的變化。分別用硼替佐米(2.6nM)、MG132(小分子蛋白酶體抑制劑)(500nM)和BAY11—7082(NF/κB通路抑制劑)(5μM)處理U266、OPM-2和MM1.S細胞12h后觀察hCDC14A的變化;6)為進一步明確hCDC14A基因在MM中的作用,構建了重組pLKO.1-shRNA-hCDC14A慢病毒載體,進行U266細胞的感染。
　　

6、 結果:第一部分:對于所有29例患者而言,hCDC14A和P53 mRNA水平無統(tǒng)計學相關性(相關系數=0.351,P=0.062);為除外因疾病狀態(tài)不同這一混雜因素對結果造成影響,僅分析24例初診患者,hCDC14A和p53 mRNA水平仍無相關性(相關系數=0.291,P=0.167)。第二部分:1)明確了我室保存的HMCLs中RPMI-8226、U266、OPM-2和LP-1為高表達hCDC14A的細胞；CZ-1、MM1.RL和M

7、M1.S為低表達細胞,以此為基礎,此后實驗以U266、OPM-2和MM1.S為主要研究對象；2)hCDC14A蛋白可廣泛定位于HMCLs的細胞核及細胞漿,部分細胞可見hCDC14A定位于中心體；3)硼替佐米能下調hCDC14A的表達,且該作用呈時間-劑量依賴性；4)硼替佐米下調hCDC14A同時S315位點磷酸化的P53蛋白表達水平上調；5)隨著硼替佐米濃度的遞增,OPM-2細胞中NF/κB活性的遞減,2.6nM硼替佐米處理OPM-2細

8、胞6h后NF/κB活性降低,但12h后NF/κB活性較6h時增強,同時NF/κB通路的抑制劑均可下調hCDC14A表達,提示硼替佐米是通過抑制NF/κB活性而對hCDC14A發(fā)揮負性調節(jié)作用。6)成功包裝了慢病毒pLKO.1-shRNA-hCDC14A并進行了U266細胞的感染,目前正在進行陽性克隆的篩選中。
　　 結論:hCDC14A的缺失是否為1p21上真正參與MM發(fā)病機制的分子目前尚缺乏足夠證據,但硼替佐米能通過抑制NF/