糖皮質(zhì)激素及TNF-α對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞GRα-GRβ、NF-κB-IκB表達(dá)的影響.pdf

1、背景： 糖皮質(zhì)激素外用制劑是治療炎癥性皮膚病的主要藥物。炎癥性皮膚病患者使用糖皮質(zhì)激素外用制劑易出現(xiàn)快速減敏和治療抵抗等現(xiàn)象。然而，這些現(xiàn)象的確切機(jī)理尚不清楚。 糖皮質(zhì)激素(GC)通過與細(xì)胞內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合而發(fā)揮作用。它們結(jié)合后形成二聚體結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。人類GR分為兩種亞型：GRα和GRβ，它們起源于GR前轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪切。共轉(zhuǎn)染檢測表明GRβ通過涉及GRα/GRβ異二聚體形

2、成的機(jī)制而具有GRα介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活的顯性負(fù)相抑制子的功能。這些異二聚體的形成可能解釋細(xì)胞中高表達(dá)GRβ導(dǎo)致的激素作用效應(yīng)降低的現(xiàn)象。GRβ對(duì)GRα活性抑制作用產(chǎn)生了這樣一種假說：多種炎癥性疾病中GRβ相對(duì)于GRα的過度表達(dá)可能扮演著細(xì)胞對(duì)激素敏感性調(diào)控的作用。 GR和核因子-κB(NF-κB)是免疫及炎癥反應(yīng)中兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)因素，但它們卻起著完全相反的調(diào)節(jié)作用。NF-κB可介導(dǎo)多種與免疫和炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子和介質(zhì)的活化過程，而GR

3、則可抑制NF-κB活化基因的表達(dá)。此外，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)也是重要的炎性細(xì)胞因子，通過激活它們的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，積極參與皮膚炎癥的病理生理過程。 我們的前期研究曾發(fā)現(xiàn)慢性皮炎表皮中GRα表達(dá)下調(diào)。然而，迄今為止，對(duì)于角質(zhì)形成細(xì)胞而言，糖皮質(zhì)激素對(duì)其GR和NF-κB/IκB的調(diào)節(jié)作用尚不明確。TNF-α在多種炎癥性皮膚病皮損局部表達(dá)增高，在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，它對(duì)GR的表達(dá)和對(duì)NF-κB/IκB的調(diào)節(jié)作用也不清楚。皮損局

4、部表皮GR和NF-κB/IκB的調(diào)節(jié)變化是否與外用糖皮質(zhì)激素所出現(xiàn)的快速減敏和治療抵抗現(xiàn)象有關(guān)也值得進(jìn)一步探索。 目的： 探討糖皮質(zhì)激素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體(GRα和GRβ)的表達(dá)、NF-κB活性及IκBα表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；比較三種不同的糖皮質(zhì)激素(氫化可的松、地塞米松、倍他米松)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體和NF-κB/IκBα調(diào)節(jié)效應(yīng)的差異：探討TNF-α對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體(GRα和GRβ)表達(dá)

5、、NF-κB活性及IκBα表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。旨在深入理解糖皮質(zhì)激素和TNF-α對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞GRα/GRβ、NF-κB/IκBα的調(diào)節(jié)作用，為正確使用糖皮質(zhì)激素外用制劑治療炎癥性皮膚病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)闡明糖皮質(zhì)激素外用制劑易出現(xiàn)快速減敏和治療抵抗現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制具有積極意義。 方法與結(jié)果： 1、應(yīng)用SP法免疫組化技術(shù)檢測慢性皮炎(慢性濕疹和慢性單純性苔蘚)與正常對(duì)照皮膚中GRα的的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與正常對(duì)照皮膚相比

6、，慢性皮炎中GRα的表達(dá)顯著下調(diào)。 2、采用反轉(zhuǎn)錄Real-TimePCR和Westernblotting，觀察經(jīng)不同濃度及不同時(shí)間的地塞米松作用下，培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞的GRα、GRβ、IκB-αmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；用Westernblotting法檢測NF-κB核蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，地塞米松對(duì)HaCaT細(xì)胞GRα與CRβ的表達(dá)有不同的調(diào)節(jié)作用。地塞米松可下調(diào)HaCaT細(xì)胞GRα的表達(dá)，呈作用時(shí)間依賴性

7、效應(yīng)。同時(shí)，地塞米松可上調(diào)HaCaT細(xì)胞GRβ的表達(dá)，呈作用濃度依賴性效應(yīng)和時(shí)間依賴性效應(yīng)。地塞米松可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞IκBα的表達(dá)而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，此作用呈濃度依賴性效應(yīng)，在36h作用最明顯。 3、將培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞分為空白對(duì)照組、氫化可的松作用組、地塞米松作用組、倍他米松作用組，采用反轉(zhuǎn)錄Real-TimePCR和Westernblotting法檢測各組HaCaT細(xì)胞的GRα、GRβ、IκBαmRN

8、A和蛋白質(zhì)表達(dá)，用Westernblotting法檢測NF-κB核蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，三種激素均具有下調(diào)HaCaT細(xì)胞GRα表達(dá)的作用，其中氫化可的松作用最弱，而地塞米松與倍他米松作用之間無明顯差異；三種激素均具有上調(diào)HaCaT細(xì)胞GRβ表達(dá)的作用，但此作用之間無明顯差異。三種激素均具有誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞IκBα的表達(dá)而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位的作用，其中氫化可的松作用最弱，而地塞米松與倍他米松作用之間無明顯差異。 4、采用反

9、轉(zhuǎn)錄Real-TimePCR和Westernblotting，觀察經(jīng)不同濃度及不同時(shí)間的腫瘤壞死因子(TNF-α)作用下，培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞的GRα、GRβ、IκBαmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，用Westernblotting法檢測NF-κB核蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，TNF-α對(duì)HaCaT細(xì)胞GRα的表達(dá)無明顯影響，但可上調(diào)HaCaT細(xì)胞GRβ的表達(dá)，并且呈劑量和時(shí)間依賴性的上調(diào)趨勢。TNF-α可抑制HaCaT細(xì)胞IκBα的

10、表達(dá)而誘導(dǎo)NF-κB的核轉(zhuǎn)位，呈作用濃度依賴性效應(yīng)，此作用在1h達(dá)到高峰，此后逐漸減弱。 結(jié)論： 1、與正常對(duì)照皮膚相比，慢性皮炎中GRα表達(dá)的下調(diào)可能會(huì)干擾皮損局部的抗炎機(jī)制并限制外用激素的療效。 2、糖皮質(zhì)激素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞GRα和GRβ表達(dá)的不同調(diào)節(jié)作用可能部分解釋外用糖皮質(zhì)激素制劑的皮膚耐受現(xiàn)象和對(duì)糖皮質(zhì)激素的抵抗。糖皮質(zhì)激素通過調(diào)控人角質(zhì)形成細(xì)胞NF-κB/IκB信號(hào)通路，可抑制皮損局部的炎癥反應(yīng)。