血清4型禽腺病毒的分離、致病性及其抗體間接免疫熒光方法的初步建立.pdf

1、禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬。根據限制性酶切圖譜以及血清交叉中和反應性，目前FAdV可分為5個種(A-E)，12個血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV在世界范圍內廣泛分布，且對不同日齡的家禽均表現(xiàn)為易感。FAdV感染一般引起亞臨床癥狀，而急性感染主要以包涵體肝炎、肝炎-心包積液綜合癥以及肌胃糜爛等為主。自2013年，國內多個省份相繼爆發(fā)FAdV-4感染引起

2、的包涵體肝炎-心包積液綜合征，對國內養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經濟損失。為了解國內流行FAdV-4的分子特征、致病特性，并建立血清學診斷方法，本研究在開展FAdV分離鑒定的基礎上，對部分FAdV-4禽腺病毒進行了全基因組測序、致病性研究，并對FAdV-4的纖突1基因進行了克隆表達，建立了檢測FAdV-4抗體的間接免疫熒光方法。
　　1.血清4型禽腺病毒FAdV-4分離鑒定及序列分析
　　對2015年送檢的疑似禽腺病毒感染的樣品進行了

3、病毒分離鑒定。結果從國內五個省份共分離、鑒定出了9株禽腺病毒，其中一株為FAdV-8，其余均為FAdV-4，并對這8株FAdV-4分離株進行了序列分析。結果發(fā)現(xiàn)，與國內2013年FAdV-4分離株JSH13及JH13相比，這8株2015年FAdV-4分離株在基因ORF29均存在不同長度的缺失。其中一株病毒的ORF29有66個堿基對缺失，其余均缺失了33個堿基對。與國外FAdV-4相比較，國內FAdV-4分離株還存在一個1961nt的缺失

4、。另外，國內FAdV-4分離株的表面纖突蛋白1及纖突蛋白2與國外毒株的同源性分別為94.4％-94.7％及93.3％-94.5％。這些結果證明了國內目前正流行新型FAdV-4。揭示這些基因組中的缺失或突變可能是導致國內雞群FAdV-4流行、爆發(fā)的原因。
　　2.血清4型禽腺病毒FAdV-4的致病性
　　為探究FAdV-4分離株的致病特性，本研究對3株FAdV-4分離株（2015年分離株SD15、JSCZ15，2013年分離株

5、JH13）在體內外進行了測定。在雞肝細胞上病毒生長特性表明，3毒株具有類似的病毒復制生長特性。SD15毒株在雞肝細胞上的病毒滴度可達1×108TCID50/mL。通過肌肉接種103TCID50病毒量，感染SD15、JSCZ15及JH13雞的致死率分別為80％，90％以及60％。泄殖腔排毒檢測發(fā)現(xiàn)，感染雞排毒一直持續(xù)到感染后第10天。病死雞解剖可見典型的肝炎-心包積液綜合癥。肝臟組織切片HE染色可見肝細胞內嗜堿性核內包涵體，脂肪變性等特征

6、病理變化。這些結果表明，這3個FAdV-4分離株為高致病性血清4型禽腺病毒。然這3個FAdV-4分離株的致病分子機制有待進一步探究。
　　3.檢測FAdV-4抗體的間接免疫熒光方法的初步建立
　　對FAdV-4纖突蛋白F1進行了PCR擴增，并利用商品化的重組酶ExnaseTMⅡ快速重組連接，成功構建了FAdV-4纖突蛋白F1真核表達載體pcDNA3.1-F1。利用抗FAdV-4的雞陽性血清，分別通過間接免疫熒光和Wester

7、n blot證明了pcDNA3.1-F1真核載體的表達及表達產物纖突蛋白F1具有良好的抗原反應性。將轉染pcDNA3.1-F1、且表達纖突蛋白F1的293T細胞作為抗原，建立了檢測FAdV-4抗體的間接免疫熒光方法。特異性檢測發(fā)現(xiàn)，該間接免疫熒光方法僅與所檢測的抗FAdV-4抗體反應，而與所檢測的抗雞馬立克病毒、禽白血病病毒、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性法氏囊炎病毒和雞傳染性支氣管炎病毒等病毒抗體不反應。這些結果表明，基于纖突蛋白