血清4型禽腺病毒的分離、致病性及其抗體間接免疫熒光方法的初步建立.pdf

1、禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬。根據(jù)限制性酶切圖譜以及血清交叉中和反應(yīng)性，目前FAdV可分為5個(gè)種(A-E)，12個(gè)血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV在世界范圍內(nèi)廣泛分布，且對(duì)不同日齡的家禽均表現(xiàn)為易感。FAdV感染一般引起亞臨床癥狀，而急性感染主要以包涵體肝炎、肝炎-心包積液綜合癥以及肌胃糜爛等為主。自2013年，國(guó)內(nèi)多個(gè)省份相繼爆發(fā)FAdV-4感染引起

2、的包涵體肝炎-心包積液綜合征，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了解國(guó)內(nèi)流行FAdV-4的分子特征、致病特性，并建立血清學(xué)診斷方法，本研究在開展FAdV分離鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)部分FAdV-4禽腺病毒進(jìn)行了全基因組測(cè)序、致病性研究，并對(duì)FAdV-4的纖突1基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，建立了檢測(cè)FAdV-4抗體的間接免疫熒光方法。
　　1.血清4型禽腺病毒FAdV-4分離鑒定及序列分析
　　對(duì)2015年送檢的疑似禽腺病毒感染的樣品進(jìn)行了

3、病毒分離鑒定。結(jié)果從國(guó)內(nèi)五個(gè)省份共分離、鑒定出了9株禽腺病毒，其中一株為FAdV-8，其余均為FAdV-4，并對(duì)這8株FAdV-4分離株進(jìn)行了序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與國(guó)內(nèi)2013年FAdV-4分離株JSH13及JH13相比，這8株2015年FAdV-4分離株在基因ORF29均存在不同長(zhǎng)度的缺失。其中一株病毒的ORF29有66個(gè)堿基對(duì)缺失，其余均缺失了33個(gè)堿基對(duì)。與國(guó)外FAdV-4相比較，國(guó)內(nèi)FAdV-4分離株還存在一個(gè)1961nt的缺失

4、。另外，國(guó)內(nèi)FAdV-4分離株的表面纖突蛋白1及纖突蛋白2與國(guó)外毒株的同源性分別為94.4％-94.7％及93.3％-94.5％。這些結(jié)果證明了國(guó)內(nèi)目前正流行新型FAdV-4。揭示這些基因組中的缺失或突變可能是導(dǎo)致國(guó)內(nèi)雞群FAdV-4流行、爆發(fā)的原因。
　　2.血清4型禽腺病毒FAdV-4的致病性
　　為探究FAdV-4分離株的致病特性，本研究對(duì)3株FAdV-4分離株（2015年分離株SD15、JSCZ15，2013年分離株

5、JH13）在體內(nèi)外進(jìn)行了測(cè)定。在雞肝細(xì)胞上病毒生長(zhǎng)特性表明，3毒株具有類似的病毒復(fù)制生長(zhǎng)特性。SD15毒株在雞肝細(xì)胞上的病毒滴度可達(dá)1×108TCID50/mL。通過肌肉接種103TCID50病毒量，感染SD15、JSCZ15及JH13雞的致死率分別為80％，90％以及60％。泄殖腔排毒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染雞排毒一直持續(xù)到感染后第10天。病死雞解剖可見典型的肝炎-心包積液綜合癥。肝臟組織切片HE染色可見肝細(xì)胞內(nèi)嗜堿性核內(nèi)包涵體，脂肪變性等特征

6、病理變化。這些結(jié)果表明，這3個(gè)FAdV-4分離株為高致病性血清4型禽腺病毒。然這3個(gè)FAdV-4分離株的致病分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。
　　3.檢測(cè)FAdV-4抗體的間接免疫熒光方法的初步建立
　　對(duì)FAdV-4纖突蛋白F1進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并利用商品化的重組酶ExnaseTMⅡ快速重組連接，成功構(gòu)建了FAdV-4纖突蛋白F1真核表達(dá)載體pcDNA3.1-F1。利用抗FAdV-4的雞陽性血清，分別通過間接免疫熒光和Wester

7、n blot證明了pcDNA3.1-F1真核載體的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物纖突蛋白F1具有良好的抗原反應(yīng)性。將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-F1、且表達(dá)纖突蛋白F1的293T細(xì)胞作為抗原，建立了檢測(cè)FAdV-4抗體的間接免疫熒光方法。特異性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該間接免疫熒光方法僅與所檢測(cè)的抗FAdV-4抗體反應(yīng)，而與所檢測(cè)的抗雞馬立克病毒、禽白血病病毒、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性法氏囊炎病毒和雞傳染性支氣管炎病毒等病毒抗體不反應(yīng)。這些結(jié)果表明，基于纖突蛋白