NDiV致病性初步研究及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立.pdf

1、目的：
　　Nam Dinh virus（以下簡稱NDiV）是近年新發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒，本課題組在國內(nèi)首次成功從成蚊中分離，但該病毒流行病學(xué)意義和檢測方法尚鮮見報(bào)道。本次研究擬建立一種特異、快速檢測成蚊中NDiV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，為環(huán)境中的蚊蟲攜帶NDiV的狀況提供快速檢測的方法提供參考。通過動物試驗(yàn)了解NDiV其致病作用，為指導(dǎo)蟲媒傳染病的控制提供依據(jù)。
　　方法：
　　用C6/36細(xì)胞培養(yǎng)Nam Dinh病毒，

2、待4-6天出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí)離心純化病毒，50％細(xì)胞終點(diǎn)法測定病毒滴度。將已測定滴度的NDiV分離物分別在蚊蟲細(xì)胞（C6/36細(xì)胞）和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)，觀察NDiV在不同細(xì)胞的生長狀況。
　　動物實(shí)驗(yàn)：
　　（a）3-4日齡乳鼠，分組處理后在乳鼠腦部、腹腔和鼻腔接種不同劑量的病毒分離液，觀察乳鼠接種病毒后的發(fā)病情況并作記錄，提取發(fā)病組織研磨液核酸做RT-PCR檢測并做病毒鑒定。
　?。╞）6日齡SPF雞胚，分組處理后在

3、SPF雞胚卵黃囊、尿囊腔、羊膜腔接種不同劑量的病毒分離液，觀察其孵育情況。
　?。╟）雛雞，分組處理后在雛雞的腦內(nèi)接種、翅膀刺種和口服的途徑接種病毒分離液，記錄出現(xiàn)癥狀的雛雞數(shù)。收集乳鼠和雞胚的發(fā)病部位或組織，研磨后提取核酸做RT-PCR檢測。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)立對照組。
　　分析NCBI中的越南和中國的NDiV病毒株全序列特征，選取保守區(qū)域RdRp基因，設(shè)計(jì)NDiV的特異性引物與TaqMan-MGB探針，通過優(yōu)化試驗(yàn)后驗(yàn)證所建立

4、方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和應(yīng)用性。建立特異性高、靈敏度強(qiáng)的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測方法。
　　結(jié)果：
　　利用建立的RT-PCR方法檢測NDiV分離物在蚊蟲細(xì)胞（C6/36細(xì)胞）和哺乳動物細(xì)胞隨時(shí)間的生長情況，檢測結(jié)果顯示病毒只在蚊蟲細(xì)胞中有增殖，在哺乳動物細(xì)胞中無生長。NDiV對C6/36細(xì)胞有明顯的病變效應(yīng)，C6/36細(xì)胞是NDiV的敏感細(xì)胞；經(jīng)C6/36細(xì)胞50%終點(diǎn)法計(jì)算得出NDiV病毒滴度為：1.41×106PF

5、U/ml。乳鼠、雞胚和雛雞的不同部位經(jīng)不同劑量的NDiV染毒后，沒有出現(xiàn)明顯的發(fā)病情況。
　　通過多次的優(yōu)化試驗(yàn)首次建立了NDiV MGB探針RT-PCR的檢測方法。該檢測方法用時(shí)短，靈敏度高，最低檢測下限為1PFU/ml。該方法有良好的特異性，與登革熱1-4血清型病毒、流行性乙型腦炎病毒、輪狀病毒、人呼吸道合胞病毒、腺病毒、星狀病毒無交叉反應(yīng)；4份核酸含量不同的NDiV標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測5次，Ct值的變異系數(shù)范圍在1.67%～3.68

6、%，有較高的穩(wěn)定性。通過檢測，龍崗區(qū)蚊蟲NDiV攜帶率為18%，以居民區(qū)、醫(yī)院和場館的蚊蟲攜帶NDiV比例最高，分別為22%、25%、31%。其它區(qū)域蚊蟲攜帶NDiV比例較低。
　　結(jié)論：
　　C6/36細(xì)胞是NDiV感染的敏感細(xì)胞，NDiV在C6/36細(xì)胞能產(chǎn)生病變效應(yīng)，但病毒在哺乳類動物細(xì)胞未見增殖。通過實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，NDiV對乳鼠及雞胚沒有明顯的致病作用。NDiV的TaqMan-MGB探針RT-PCR方法是一種特異、快