登革病毒血清抗體分型方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　登革病毒(Dengue virus，DENV)包膜蛋白第Ⅲ結(jié)構(gòu)域(Envelope domainⅢ，EDⅢ)介導(dǎo)病毒吸附感染受體細(xì)胞，并刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)DENV的型特異性抗體。二次異型DENV感染時(shí)，由于抗體依賴感染增強(qiáng)作用(Antibody dependent enhancement，ADE)，體內(nèi)存在的登革病毒抗體會(huì)導(dǎo)致感染增強(qiáng)并誘發(fā)重癥登革熱(Severe dengue fever，SD)。通過(guò)檢測(cè)登革熱(Den

2、gue fever，DF)患者體內(nèi)已存在的抗體型別，結(jié)合本次感染的病毒型別，判斷是否發(fā)生二次異型感染，可用于評(píng)估患者發(fā)展為重癥登革熱的風(fēng)險(xiǎn)。目前，登革病毒血清抗體分型可以通過(guò)蝕斑減少中和實(shí)驗(yàn)(Plaque reductionneutralization test，PRNT)實(shí)現(xiàn)，但由于PRNT技術(shù)操作繁雜且耗時(shí)，主要局限在科研中應(yīng)用。因此臨床急需建立一種能簡(jiǎn)單、快速對(duì)登革病毒血清型特異性抗體分型的新技術(shù)。本研究擬通過(guò)原核基因工程技術(shù)獲得

3、登革病毒EDⅢ重組蛋白，建立ELISA檢測(cè)方法對(duì)登革病毒血清特異性抗體分型，并初步評(píng)價(jià)該方法的診斷效果。為今后應(yīng)用于臨床DF患者病情的評(píng)估，預(yù)測(cè)重癥登革熱的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)登革熱流行地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。
　　方法:
　　1.利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增登革1型和2型病毒EDⅢ基因，構(gòu)建原核基因表達(dá)載體pET28b-EDⅢ，轉(zhuǎn)化BL21后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-M

4、S)鑒定重組蛋白，采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白。
　　2.利用高碘酸鈉法對(duì)登革1型和2型病毒EDⅢ重組蛋白進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記，經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化酶標(biāo)記蛋白。
　　3.建立登革1型和2型病毒血清抗體分型檢測(cè)的雙抗原夾心ELISA法，對(duì)抗原包被濃度、酶標(biāo)抗原濃度、標(biāo)本稀釋度以及顯色時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　4.利用自建的分型ELISA法檢測(cè)登革熱患者恢復(fù)期血清

5、標(biāo)本，與登革病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒和PRNT方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估登革1型和2型病毒血清抗體分型ELISA方法檢測(cè)性能。
　　成果:
　　1.成功誘導(dǎo)表達(dá)登革1型和2型病毒EDⅢ重組蛋白，兩種重組蛋白均主要以包涵體蛋白形式表達(dá);MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果顯示兩種重組蛋白分別是登革1型和2型病毒EDⅢ蛋白;采用鎳親和層析技術(shù)獲得高純度的重組蛋白。
　　2.利用高碘酸鈉法獲得酶標(biāo)記蛋白EDⅢ-HRP，并通過(guò)凝

6、膠過(guò)濾層析法成功純化了酶標(biāo)記蛋白EDⅢ-HRP。
　　3.建立了登革1型和2型病毒血清抗體分型檢測(cè)的雙抗原夾心ELISA法，方法條件優(yōu)化結(jié)果顯示最佳抗原包被濃度和酶標(biāo)抗原濃度均為1μ g/mL，血清最佳稀釋度為1∶40，最佳顯色時(shí)間為20min。
　　4.48例登革1型病毒感染患者恢復(fù)期血清標(biāo)本，登革病毒IgG ELISA檢測(cè)試劑盒和自建1型IgG ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率均為83.3％(40/48)，低于PRNT的陽(yáng)性率(95

7、.8％);自建1型IgG ELISA和PRNT之間存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.4590，P＜0.01。11例登革2型病毒感染患者恢復(fù)期血清標(biāo)本，自建2型IgG ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性率為81.8％(9/11)，高于登革病毒IgG檢測(cè)ELISA試劑盒陽(yáng)性率(45.5％)。自建1型IgG ELISA和2型病毒感染患者血清之間的交叉反應(yīng)為22.9％(11/48)，自建2型IgG ELISA和1型病毒感染患者血清之間的交叉反應(yīng)為45.5％(5/