AP-2α表達降低引起EGF receptor過表達以及SW480細胞體外惡性增殖與侵襲能力增強.pdf

1、目的： 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α(Transcription factor activator protein-2α)屬于轉(zhuǎn)錄因子AP-2(Transcription factor activator protein-2，AP-2)家族，是一種特異性DNA結合蛋白，分子量約為52kD。AP-2α作為一種特異性核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種靶基因的表達，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育以及細胞的生長分化。國外研究發(fā)現(xiàn)，AP-2α在多種腫瘤包括結直腸癌中表達降低或缺

2、失，提示AP-2α在結腸癌發(fā)生發(fā)展中起著腫瘤抑制基因的作用。本研究進一步探討AP-2α的表達降低或缺失參與結腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機制。 方法： 本研究采用基因工程技術，以pcDNA3.1(+)為表達載體，構建了攜帶野生型AP-2α基因的pcDNA3.1(+)-hAP-2α真核表達質(zhì)粒；在脂質(zhì)體介導下將pcDNA3.1(+)-hAP-2α和pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染人結腸癌細胞株-SW480細胞，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應

3、(RT-PCR)、Western blot分析與凝膠遷移率變動分析(EMSA)對AP-2α在SW480細胞中的表達及其活性進行鑒定；利用MTT法和軟瓊脂克隆形成試驗體外觀察AP-2α對SW480細胞惡性增殖能力的影響；利用Transwell侵襲試驗體外觀察AP-2α對SW480細胞侵襲能力的影響。 利用PCR技術從SW480細胞基因組DNA中擴增表皮生長因子受體(Epidermal growthfactor receptor,E

4、GF receptor)基因啟動子，將其構建入pMD-18T載體，并進行測序；根據(jù)該段啟動子區(qū)域中5個可能的AP-2α結合位點設計5對寡核苷酸探針，利用EMSA技術體外水平檢測各組細胞的核蛋白與這5對寡核苷酸探針的結合情況；進一步利用RT-PCR技術和Western blot分析檢測轉(zhuǎn)染AP-2α基因后SW480細胞中內(nèi)源性EGF receptor基因的表達。 結果： 成功構建攜帶野生型AP-2α基因的pcDNA3.1(

5、+)-hAP-2α真核表達質(zhì)粒；野生型AP-2α基因在人結腸癌細胞株-SW480細胞中獲得高水平表達，并且表達的AP-2α蛋白具有較強的DNA結合活性；MTT結果提示轉(zhuǎn)染AP-2α基因后SW480細胞增殖趨緩，軟瓊脂克隆體積小且數(shù)量少，細胞侵襲能力下降。 成功擴增SW480細胞基因組DNA中EGF receptor基因的啟動子區(qū)域，并構建入pMD-18T載體，測序結果顯示該段啟動子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)有任何可能導致反式作用因子結合能力異常

6、的基因缺失、重排或者突變；EMSA結果顯示，SW480細胞中表達的AP-2α蛋白與3對探針發(fā)生特異性結合，且結合強度不等；轉(zhuǎn)染AP-2α基因后，SW480細胞中內(nèi)源性EGFreceptor mRNA含量和蛋白表達水平顯著下調(diào)。 結論： 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α可以抑制人結腸癌細胞株-SW480細胞體外惡性增殖以及侵襲能力，其作用機制可能與通過直接作用于EGF receptor基因啟動子區(qū)域從而下調(diào)內(nèi)源性EGF receptor