上調(diào)Twist基因?qū)W480細胞株體外增殖及侵襲性影響的研究.pdf

1、目的:Twist基因是存在于人、果蠅、鼠等生物體內(nèi)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basichelix loop helix,bHLH)蛋白,作為一種轉(zhuǎn)錄因子,主要表達于胚胎胎盤、中胚層及成人的某些中胚層來源的未分化組織。Twist表達的蛋白在人有202個氨基酸、小鼠有206個氨基酸、蟾蜍有166個氨基酸序列構(gòu)成,其中人類和小鼠的氨基酸序列具有96％的同源性,在不同的種屬中其DNA結(jié)合區(qū)域有著100％的序列保守,所有Twist基因都能結(jié)合E-bo

2、x的DNA序列:CANNTG。Twist基因在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多種基因的表達[1],最初是在胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)它的生物學(xué)功能,它可以通過促進上皮.間葉變(epithelial mesenchymal transition,EMT)來調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育。近期研究結(jié)果證實[2,3]Twist具有癌基因的特性,能夠編碼凋亡抑制蛋白,通過多個信號系統(tǒng)參與腫瘤的發(fā)生:抑制分化,通過降低P53上游的調(diào)控因子ARF的表達阻斷P53信號通路,阻礙N-myc信

3、號系統(tǒng)的傳遞,和抑制NF-κΒ通路等。它還參與了多種上皮來源的腫瘤細胞發(fā)生EMT并促進癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移,同時Twsit基因在腫瘤進展中可以誘導(dǎo)一系列間充質(zhì)標(biāo)志物的產(chǎn)生。研究表明,Twist基因高表達于多種實體瘤中(包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤以及骨肉瘤),并能夠促進人乳腺癌和黑色素瘤細胞系的凋亡。之前我們已經(jīng)有研究證實Twist基因在結(jié)腸癌細胞株HCT116中呈高表達,而在SW480細胞株中呈低表達,本實驗通過將高表達Twist基因的質(zhì)

4、粒轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌SW480細胞株中,觀察Twist基因?qū)毎鲋臣扒忠u性的影響。
　　 方法:
　　 本研究將高表達Twig基因的質(zhì)粒和陰性對照的空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入SW480細胞株中,通過G418篩選后,分別命名為轉(zhuǎn)染組和對照組,經(jīng)過RT-PCR和Western-blot方法的鑒定,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細胞,再通過MTT法繪制轉(zhuǎn)染組細胞和對照組細胞的生長曲線,然后通過細胞劃痕實驗和Transw

5、ell侵襲實驗,觀察Twist基因?qū)毎w移能力和侵襲力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1：RT-PCR和Western-blot方法檢測結(jié)果顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細胞中TwistmRNA和Twist蛋白表達量均顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。
　　 2：通過MTT法繪制細胞生長曲線,結(jié)果顯示,從第4天開始,轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細胞生長速度明顯高于對照組(P＜0.05)。
　　

6、 3：通過細胞劃痕實驗顯示,劃痕24小時后轉(zhuǎn)染組細胞遷移了(40.06±5.56),而對照組細胞遷移了(25.24±2.65),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。48小時后,轉(zhuǎn)染組細胞遷移了(75.77±8.06),而對照組遷移了(35.37±6.79),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4：體外侵襲實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細胞發(fā)生侵襲的個數(shù)為(154±12),未轉(zhuǎn)染組細胞侵襲個數(shù)為(73±14),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

7、P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1：通過本實驗Twist基因成功轉(zhuǎn)入SW480細胞株并且呈穩(wěn)定表達。
　　 2：上調(diào)Twist基因表達后,SW480細胞體外增殖率明顯上升,說明Twist基因能夠增強SW480細胞的體外增殖能力。
　　 3：上調(diào)Twist基因表達后,SW480細胞體外遷移能力明顯增強,說明Twist基因能夠增強SW480細胞的遷移能力。
　　 4：上調(diào)Twist基因表達后,S