細(xì)絲蛋白A通過(guò)ERK通路抑制SW480細(xì)胞體外侵襲機(jī)制的研究.pdf

1、目的:結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤,在40～60歲為高患病率年齡段,是全世界癌癥死亡的主要原因。在我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率與死亡率位于全部惡性腫瘤的第4～6位,僅次于胃癌、肺癌及食管癌等常見(jiàn)惡性腫瘤。近年各地方資料顯示隨著國(guó)人生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)多級(jí)的復(fù)雜的進(jìn)程,包括抑癌基因突變和丟失,原癌基因激活等等。信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的異常在腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段貫

2、穿。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。細(xì)絲蛋白A(filamin A,FLNa)是結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中重要的抑制因子。FLNa表達(dá)降低或缺失與正常結(jié)直腸組織向惡性發(fā)展有關(guān),但是,FLNa抑制腫瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)的具體機(jī)制尚不清楚。因此,揭示惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的確切分子機(jī)制已成為臨床提高腫瘤治療效果的迫切需要,這一領(lǐng)域也成為分子腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)等基礎(chǔ)理論學(xué)科研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究將探討FLN

3、a基因通過(guò)ERK通路抑制SW480細(xì)胞體外侵襲機(jī)制的研究。
　　 方法:
　　 1：將FLNa基因質(zhì)粒載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa,以脂質(zhì)體介導(dǎo)方式轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。經(jīng)G418篩選,獲得FLNa基因穩(wěn)定表達(dá)的SW480/FLNa,細(xì)胞。RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)FLNa基因的導(dǎo)入情況。
　　 2：以SW480細(xì)胞及成功轉(zhuǎn)染FLNacDNA的SW480/FLNa細(xì)胞作為研究對(duì)

4、象,觀察經(jīng)U0126和EGF處理后,Western blot檢測(cè)SW480和SW480/FLNa細(xì)胞質(zhì)ERK(ERK)、細(xì)胞核內(nèi)磷酸化ERK(p-ERK)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinases-9,MMP-9)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 3：分別檢測(cè)SW480、經(jīng)U0126處理20分鐘后SW480和SW480/FLNa胞質(zhì)ERK、胞核P-ERK、胞質(zhì)MMP-9蛋白表達(dá);檢測(cè)SW480/FLNa

5、、經(jīng)EGF處理20分鐘后SW480/FLNa和SW480胞質(zhì)ERK、胞核p-ERK、胞質(zhì)MMP-9蛋白表達(dá)。
　　 4：研究FLNa在ERK信號(hào)通路對(duì)SW480細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1：RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞FLNamRNA的表達(dá)結(jié)果顯示,以GAPDH作內(nèi)參照,以FLNa/GAPDH值來(lái)定量,SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平分別為1.2

6、7±0.11、0.12±0.02和0.14±0.03。SW480/FLNa細(xì)胞FLNamRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。(Fig.1)2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞FLNa蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示,以GAPDH作內(nèi)參照,以FLNa/GAPDH值來(lái)定量,SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平分別為0.78±0.03、0.01±0.00和0.01±0.00。SW480/FLNa細(xì)胞mRNA的表達(dá)明顯高于

7、對(duì)照組。(Fig.2)3 Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)U0126處理5、10、20和30min后,SW480細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ERK表達(dá)水平分別為0.91±0.03、0.85±0.01、0.14±0.02和0.13±0.04。經(jīng)處理20min后,U0126對(duì)ERK的表達(dá)達(dá)到最大抑制效果。(Fig.3)4 Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)EGF處理5、10、20和30min后,SW480/FLNa細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ERK表達(dá)水平分別為0.17±0

8、.03、0.15±0.01、0.81±0.03和0.76±0.04。經(jīng)EGF刺激20min后,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ERK達(dá)到最高水平。(Fig.4)5 Western blot結(jié)果顯示,SW480、經(jīng)U0126處理20分鐘后SW480和SW480/FLNa胞質(zhì)ERK表達(dá)水平分別為:0.51±0.04、0.08±0.01和0.09±0.00;胞核P-ERK表達(dá)水平分別為:0.44±0.05、0.00±0.00和0.01±0.00;胞質(zhì)MMP-9蛋白

9、表達(dá)水平分別為:0.43±0.04、0.00±0.00和0.00±0.00。結(jié)果顯示SW480細(xì)胞胞漿和胞核P-ERK的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。(Fig.5)6 Western blot結(jié)果顯示,SW480/FLNa、經(jīng)EGF處理20分鐘后SW480/FLNa和SW480胞質(zhì)內(nèi)ERK表達(dá)水平分別為:0.07±0.00、0.71±0.03和0.78±0.03;胞核內(nèi)磷酸化ERK表達(dá)水平分別為:0.02±0.00、0.22±0.02和0.29±

10、0.04;胞質(zhì)內(nèi)MMP-9表達(dá)水平分別為:0.01±0.00、0.61±0.05和0.42±0.04。結(jié)果顯示EGF處理后SW480/FLNa細(xì)胞胞漿和胞核P-ERK的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。(Fig.6)7 SW480、經(jīng)U0126處理20分鐘后SW480和SW480/FLNa細(xì)胞的體外侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,SW480、經(jīng)U0126處理20分鐘后SW480和SW480/FLNa組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為213±15、82±13和75±11。說(shuō)明未

11、轉(zhuǎn)染FLNa的SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著增高。(Tablel)8 SW480/FLNa、經(jīng)EGF處理20分鐘后SW480/FLNa和SW480細(xì)胞的體外侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,SW480/FLNa、經(jīng)EGF處理20分鐘后SW480/FLNa和SW480組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為54±12、125±15和130±14。說(shuō)明轉(zhuǎn)染FLNacDNA后,細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著降低。(Table2)。
　　 結(jié)論:
　　 1分別