糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中骨橋蛋白變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、　　背景：
　　近年來由于膳食結(jié)構(gòu)的改變,糖尿病發(fā)病率逐年上升,糖尿病病人處于長期高血糖和氧化應(yīng)激狀態(tài),可以引起各種并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅著患者的健康,糖尿病繼發(fā)骨質(zhì)疏松癥近幾年開始被醫(yī)學(xué)界重視。事實(shí)上,糖尿病合并骨質(zhì)疏松是一個(gè)常見的危害性很大的糖尿病慢性并發(fā)癥。李桂英研究發(fā)現(xiàn)糖尿病組骨質(zhì)疏松發(fā)病率為55.9%,對(duì)照組為43.2%,糖尿病組中骨質(zhì)疏松發(fā)生率明顯高于對(duì)照組,李蓬秋等報(bào)道糖尿病繼發(fā)骨質(zhì)疏松發(fā)病率為50%~60%。骨質(zhì)疏松

2、癥易導(dǎo)致骨折(常見于腕部、椎體、髖關(guān)節(jié)),致殘率高,給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松一旦發(fā)生,不可逆轉(zhuǎn),所以重在預(yù)防。了解它的發(fā)病機(jī)理,提前治療就顯得非常重要。
　　糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制,是多因素所致的結(jié)果,與體內(nèi)物質(zhì)代謝和多因素的調(diào)控障礙有著密切的關(guān)系。通常認(rèn)為發(fā)病機(jī)理有：
　　(1)胰島素缺乏： 臨床研究發(fā)現(xiàn),糖尿病病人胰島素水平與骨密度呈正相關(guān)。已經(jīng)證明成骨細(xì)胞表面有胰島素受體和胰島素樣生長因子-1(I

3、GF-1)受體。胰島素缺乏可導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換下降,引起骨質(zhì)疏松。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼生發(fā)中心IGF-1、IGF-l受體和胰島素受體表達(dá)水平降低,表現(xiàn)為骨骼礦化下降,小鼠發(fā)育遲緩；胰島素不足時(shí),直接刺激作用減弱,成骨細(xì)胞數(shù)目減少、活性降低,抑制成骨細(xì)胞合成骨鈣素,使骨吸收大于骨形成；胰島素缺乏,影響成骨細(xì)胞對(duì)膠原的合成,導(dǎo)致骨基質(zhì)減少；胰島素缺乏,1,25(OH)2D3合成減少,導(dǎo)致成骨細(xì)胞分泌OC下降；胰淀素是胰島β細(xì)

4、胞分泌的一種多肽,由37個(gè)氨基酸組成,是另一種促進(jìn)骨形成的因子,糖尿病患者胰淀素缺乏,體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)胰淀素能夠抑制破骨過程,外源性給予胰淀素能夠保持骨量、增加骨形成指標(biāo)物。
　　(2)鈣磷代謝異常：高血糖時(shí)尿液滲透壓增高,大量鈣、磷、鎂離子排出體外；高滲透壓可導(dǎo)致腎小管對(duì)鈣、磷、鎂的重吸收減少。
　　(3)高血糖對(duì)骨代謝的影響：葡萄糖是破骨細(xì)胞的基本能量來源,體外試驗(yàn)表明,葡萄糖能夠劑量依賴性增加鳥類破骨細(xì)胞活性。另

5、外,高血糖導(dǎo)致各種骨蛋白非酶糖化,損害骨質(zhì)量。
　　(4)甲狀旁腺激素：糖尿病患者甲狀旁腺激素分泌增加,從尿液中丟失的鈣增多。
　　但是,糖尿病繼發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理,目前尚無統(tǒng)一的認(rèn)識(shí),甚至一些專家有相反的結(jié)論。
　　骨橋蛋白(osteopontin,OPN)又叫骨橋素,是一種特殊的精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸(RGD)序列磷酸化糖蛋白(secreted phosphoprotein,SPP),是由成骨細(xì)胞和

6、OC產(chǎn)生的非膠原蛋白。OPN與骨代謝、抗感染免疫、平滑肌細(xì)胞增生、動(dòng)脈硬化、糖尿病腎臟病變等多種生理、病理現(xiàn)象密切相關(guān)。磷酸化的OPN可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能,硫化型的OPN與成骨細(xì)胞的功能有密切關(guān)系,可調(diào)節(jié)培養(yǎng)成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成。同時(shí),OPN參與了破骨細(xì)胞破骨過程的調(diào)節(jié),在骨吸收停止后,OPN位于粘合帶處。根據(jù)已有的報(bào)道,OPN在骨形成和骨代謝平衡方面起著重要作用,OPN缺失或阻斷OPN蛋白對(duì)骨質(zhì)破壞疾病療效顯著,但是OPN

7、這些功能的具體作用機(jī)制還不是很清楚。體外研究發(fā)現(xiàn),OPN缺失或者抗OPN單抗可以降低RANKL誘導(dǎo)的OC分化,減少骨吸收功能,與其相關(guān)的OC的粘附、遷移和存活功能也有不同程度減弱。研究表明,OPN可能是通過RANK/TRAF6介導(dǎo)的信號(hào)通路來干預(yù)OC分化形成,影響其生物學(xué)功能。這可能是OPN的作用機(jī)制。目的：
　　通過對(duì)糖尿病大鼠繼發(fā)骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)觀察,觀察大鼠骨密度的變化,血尿生化指標(biāo)檢測尿鈣、尿肌配、血清骨鈣素、血清鈣),

8、探討糖尿病引起骨質(zhì)疏松的機(jī)理,了解其通過引起骨橋蛋白變化,影響破骨細(xì)胞作用,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的過程,闡明發(fā)病過程。為治療提供思路。
　　方法：
　　選用健康2月齡雄性Wistar大鼠24只,隨機(jī)選12只大鼠為空白對(duì)照組,余12只雄性Wistar大鼠為模型組。造模方法：一次腹腔注STZ55mg/kg(溶于檸檬酸緩沖液中,pH4.5),7d 后測定血糖, 空腹血糖水 16.7mmolPL(300mgPkg)為糖尿病模型成功的

9、標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組注射等量檸檬酸緩沖液。
　　(1)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4個(gè)月時(shí)收集12小時(shí)空腹尿液,測定尿鈣(Ca)與尿肌配(Cr),計(jì)算出 Ca/Cr比值；抽血 4m1。采用放射免疫法測定血清骨鈣素(BoneΥ-carboxyglutamic acid,BGP),自動(dòng)生化分析儀測定血清鈣(Ca)。
　　(2)LunarProdigy雙能X線骨密度儀測定右側(cè)脛骨和股骨的骨礦物密度,用小動(dòng)物分析軟件進(jìn)行分析。
　　(3)取脛

10、骨近端干髓端松質(zhì)骨,提取OPN總RNA,進(jìn)行PCR-RT定量。
　　(4)骨組織形態(tài)學(xué)觀察。
　　結(jié)果：
　　(1)骨密度變化情況：觀察組顯著低于對(duì)照組(P　　(2)血、尿生化指標(biāo)：尿Ca與Ca/Cr比值,觀察組顯著高于對(duì)照組(P　　(3)骨橋蛋白mRN

11、A水平表達(dá)：觀察組OPN/β-actin比值高于對(duì)照組OPN/β-actin比值,比值差異有顯著性(P　　(4)骨組織形態(tài)學(xué)觀察：觀察組骨小梁纖細(xì),形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性差,骨髓腔大小不勻,靜板層結(jié)構(gòu)疏松,有散在的吸收陷窩。對(duì)照組骨小梁粗壯,骨髓腔相對(duì)較小,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,骨板層結(jié)構(gòu)致密。
　　結(jié)論：
　　(1)動(dòng)物模型的建立：我們一次腹腔注射 STZ55mg/kg(溶于檸檬酸緩沖液中,pH4.5),

12、7d后測定血糖,篩選模型成功的大鼠,造模成功。飼養(yǎng)4月后,觀察骨密度,骨組織形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)糖尿病繼發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠造模成功。
　　(2)生化檢測：糖尿病可以引起大鼠尿Ca與Ca/Cr比值增高；血清鈣無顯著變化；血清骨鈣素水平降低。加快骨丟失,影響骨吸收和骨形成間的平衡,破壞骨組織結(jié)構(gòu)。
　　(3)骨橋蛋白mRNA水平表達(dá)：糖尿病大鼠OPN/β-actin比值高于對(duì)照組OPN/β-actin比值,在骨骼組織中高表達(dá),進(jìn)一