多西紫杉醇誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡與survivin基因表達(dá)的研究.pdf

1、背景和目的：喉癌是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤,它占耳鼻喉科惡性腫瘤的11％~22％,病理上約有95％~99％為鱗狀細(xì)胞癌。盡管隨著科技的發(fā)展,早期診斷技術(shù)不斷提高,但臨床晚期病例仍占45.2％左右。傳統(tǒng)上以根治性手術(shù)、放療為主,5年生存率為30％~50％。本世紀(jì)80年代以來(lái)隨著藥物的研究進(jìn)展,喉癌的治療特別是晚期腫瘤多主張手術(shù)、放療、化療和免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用。近幾年來(lái),大量研究證實(shí)多西紫杉醇用于頭頸部腫瘤的治療已取得令人鼓舞的初步療效,單

2、獨(dú)或聯(lián)合其他抗癌藥物的有效率可達(dá)到22％~75％。然而,腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生已經(jīng)成為影響其進(jìn)一步治療效果的重要因素。目前,腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥機(jī)制尚不明了。近年來(lái)的研究認(rèn)為,凋亡是化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的主要模式,而藥物作用后腫瘤細(xì)胞發(fā)生的凋亡調(diào)節(jié)的改變可能是藥物耐藥產(chǎn)生的重要因素。細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族(inhibitor ofapoptosisprotein,IAP)在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性方面起著核心作用。survivin是

3、凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protien,IAP)家族中最受重視的一名新成員。survivin的分布不同于家族中其他成員,它只分布在胚胎組織和腫瘤組織,且在不同細(xì)胞系中表達(dá)量和亞細(xì)胞定位不同,也是迄今為止分子量最小、抗凋亡作用最強(qiáng)的IAP。它通過抑制半胱氨酸蛋白酶caspase末端效應(yīng)因子caspase3、7的活性,從而抑制細(xì)胞凋亡。近年來(lái)survivin基因參與腫瘤的演變、診斷、治療以及抗腫瘤藥物

4、耐藥的機(jī)制成為了研究的熱點(diǎn)。
　　本研究選擇了多西紫杉醇體外作用人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞,觀察用藥不同時(shí)間點(diǎn)及濃度下喉癌細(xì)胞內(nèi)survivin mRNA表達(dá)的變化,結(jié)合誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡的情況,分析survivin基因與藥物誘導(dǎo)的喉癌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,進(jìn)而探討survivin基因表達(dá)的改變與喉癌細(xì)胞化療耐藥的關(guān)系。
　　方法：體外培養(yǎng)喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞,待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。多西紫杉醇由原液稀釋成2000μ

5、g/ml濃度后開始作連續(xù)倍比稀釋,作7個(gè)濃度梯度,應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)不同藥物濃度對(duì)Hep-2細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用,計(jì)算出藥物24h、48h對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),并根據(jù)藥物的IC50,選擇2IC50和1/2IC50作為高、低兩個(gè)濃度作用于細(xì)胞。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)物高濃度處理24h,低濃度處理12、24、48h后存活Hep-2細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)水平。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況,以凋亡指數(shù)(AI

6、)表示凋亡狀態(tài)。同時(shí)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增survivin基因,顯示不同時(shí)間及濃度下survivin基因表達(dá)量的改變。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料用(?)±s表示,采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD法。判定標(biāo)準(zhǔn):P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.多西紫杉醇對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響隨著多西紫杉醇濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)(

7、P<0.01)。研究得出多西紫杉醇對(duì)Hep-2細(xì)胞24h的IC50值為7.47ug/ml,95％CI[4.91~10.73];48h的IC50值為4.32ug/ml,95％CI[2.54~6.39]。2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化倒置顯微鏡下觀察到藥物作用后,細(xì)胞貼壁能力、折光性明顯減弱,生長(zhǎng)增殖明顯受抑。多西紫杉醇作用4h即可見形態(tài)改變,當(dāng)濃度至80μg/ml作用72h,可見大量細(xì)胞漂浮,細(xì)胞形態(tài)由多邊形、長(zhǎng)梭形,變?yōu)轭悎A形。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

8、Hep-2細(xì)胞的凋亡低濃度多西紫杉醇(3.7ug/ml)作用細(xì)胞24h后出現(xiàn)凋亡峰(亞G1峰),之后的48h組凋亡率明顯增加(p<0.05)。高濃度(15.0μg/ml)作用24h后也出現(xiàn)凋亡峰,且其表達(dá)量略高于低濃度藥物作用24h組(p<0.05)。G2/M期阻滯的高峰出現(xiàn)在多西紫杉醇作用Hep-2細(xì)胞后的12h,隨后的24、48h G2/M期細(xì)胞阻滯的比例逐漸下降。4.多西紫杉醇作用Hep-2細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)的變

9、化多西紫杉醇高、低濃度作用Hep-2細(xì)胞后,存活細(xì)胞中survivin mRNA基因的表達(dá)均高于陰性對(duì)照(P<0.05),但是高、低濃度間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而低濃度連續(xù)作用后,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),存活細(xì)胞中survivinmRNA表達(dá)量逐漸增加(P<0.05)。藥物處理12、24、48h后的存活細(xì)胞內(nèi)的survivinmRNA的表達(dá)量分別為陰性對(duì)照組的1.40倍、2.76倍、3.68倍。
　　結(jié)論：1.多西紫杉醇