塞來昔布誘導喉癌Hep-2細胞凋亡及細胞周期阻滯的實驗研究.pdf

1、研究背景:喉癌在頭頸部是一種比較常見的惡性腫瘤，近十年來其發(fā)病率有逐年升高的趨勢。其傳統(tǒng)治療方法是手術(shù)切除，并根據(jù)患者情況輔助放療或化療。根據(jù)臨床分期及病理分級，采取手術(shù)和（或）化療及化療聯(lián)合放療的綜合治療，被認為是喉癌治療的理想方案。合理的化療和（或）化療聯(lián)合放療對于晚期及復發(fā)型喉癌病人總生存率、器官保留較傳統(tǒng)手術(shù)都有提高。選擇一種副作用小且有效的化療藥物在喉癌綜合治療中有重要作用。近十年來環(huán)氧化酶-2(COX-2)作為新的腫瘤治療靶

2、點成為腫瘤研究的熱點，塞來昔布作為其特異性抑制劑，最初被美國FDA批準治療疼痛，近年來發(fā)現(xiàn)其可以誘導包括消化道腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤生長，但塞來昔布在喉癌的臨床應用和基礎(chǔ)研究報道均較少。本研究，針對環(huán)氧化酶-2在人喉癌細胞系Hep-2細胞中的表達，及塞來昔布誘導Hep-2細胞凋亡和細胞周期阻滯進行初步研究，為探討喉癌化療敏感性提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.探討COX-2在喉癌Hep-2細胞系中的表達及

3、塞來昔布對COX-2表達的影響;
　　2.初步探討塞來昔布誘導Hep-2細胞凋亡及可能的機制。
　　3.初步探討塞來昔布誘導Hep-2細胞周期阻滯及可能的機制。
　　方法:
　　以不同濃度的塞來昔布處理喉癌Hep-2細胞，以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測對細胞增殖活力的影響;Hoechst33342對細胞進行染色，熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)改變;Annexin Ⅴ/PI雙染以流式細胞儀檢測細胞的凋亡率;透射電鏡

4、觀察塞來昔布處理后的細胞超微結(jié)構(gòu)改變;JC-1染色，熒光顯微鏡下觀察細胞線粒體膜電位的改變;Western blot檢測:Bcl-2、Bax及COX-2的表達，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinaseinhibitor;CKI)P16INKa、P21waf/cip1、P27KIP的表達，以及分析Caspase-3、PARP裂解和AIF從線粒體釋放到細胞核。
　　結(jié)果:
　　1.COX-2

5、在喉癌Hep-2細胞系中存在表達且其表達受塞來昔布抑制。
　　2.MTT結(jié)果顯示塞來昔布在10-100μmol/L濃度范圍可抑制Hep-2細胞的增殖活力，并呈時間和濃度依賴性。Hoechst33342染色及電鏡結(jié)果可見鏡下典型凋亡的形態(tài)改變;流式細胞儀結(jié)果顯示Hep-2細胞凋亡率隨塞來昔布濃度增加而升高。
　　3.流式細胞儀分析細胞周期分布可見細胞周期阻滯于G0/G1期。
　　4.JC-1染色可知，隨著塞來昔布處理時間

6、的延長，線粒體膜電位逐漸下降。
　　5.western blot結(jié)果見:隨著塞來昔布濃度的升高，Bax/Bcl-2蛋白比值升高，P16INK4a、P27KIP表達增加，P21waf/cip1表達無明顯改變;隨著塞來昔布處理時間的延長，caspase-3蛋白、PARP蛋白逐漸出現(xiàn)裂解片斷，AIF蛋白逐漸從線粒體釋放移位到細胞核。
　　結(jié)論:
　　塞來昔布抑制腫瘤細胞增殖活性機制可能與其誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯有關(guān)。塞來