塞來昔布誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:喉癌在頭頸部是一種比較常見的惡性腫瘤，近十年來其發(fā)病率有逐年升高的趨勢。其傳統(tǒng)治療方法是手術(shù)切除，并根據(jù)患者情況輔助放療或化療。根據(jù)臨床分期及病理分級，采取手術(shù)和（或）化療及化療聯(lián)合放療的綜合治療，被認(rèn)為是喉癌治療的理想方案。合理的化療和（或）化療聯(lián)合放療對于晚期及復(fù)發(fā)型喉癌病人總生存率、器官保留較傳統(tǒng)手術(shù)都有提高。選擇一種副作用小且有效的化療藥物在喉癌綜合治療中有重要作用。近十年來環(huán)氧化酶-2(COX-2)作為新的腫瘤治療靶

2、點(diǎn)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，塞來昔布作為其特異性抑制劑，最初被美國FDA批準(zhǔn)治療疼痛，近年來發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)包括消化道腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤生長，但塞來昔布在喉癌的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究報(bào)道均較少。本研究，針對環(huán)氧化酶-2在人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)，及塞來昔布誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯進(jìn)行初步研究，為探討喉癌化療敏感性提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.探討COX-2在喉癌Hep-2細(xì)胞系中的表達(dá)及

3、塞來昔布對COX-2表達(dá)的影響;
　　2.初步探討塞來昔布誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡及可能的機(jī)制。
　　3.初步探討塞來昔布誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞周期阻滯及可能的機(jī)制。
　　方法:
　　以不同濃度的塞來昔布處理喉癌Hep-2細(xì)胞，以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測對細(xì)胞增殖活力的影響;Hoechst33342對細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)改變;Annexin Ⅴ/PI雙染以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率;透射電鏡

4、觀察塞來昔布處理后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變;JC-1染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體膜電位的改變;Western blot檢測:Bcl-2、Bax及COX-2的表達(dá)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinaseinhibitor;CKI)P16INKa、P21waf/cip1、P27KIP的表達(dá)，以及分析Caspase-3、PARP裂解和AIF從線粒體釋放到細(xì)胞核。
　　結(jié)果:
　　1.COX-2

5、在喉癌Hep-2細(xì)胞系中存在表達(dá)且其表達(dá)受塞來昔布抑制。
　　2.MTT結(jié)果顯示塞來昔布在10-100μmol/L濃度范圍可抑制Hep-2細(xì)胞的增殖活力，并呈時間和濃度依賴性。Hoechst33342染色及電鏡結(jié)果可見鏡下典型凋亡的形態(tài)改變;流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示Hep-2細(xì)胞凋亡率隨塞來昔布濃度增加而升高。
　　3.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布可見細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。
　　4.JC-1染色可知，隨著塞來昔布處理時間

6、的延長，線粒體膜電位逐漸下降。
　　5.western blot結(jié)果見:隨著塞來昔布濃度的升高，Bax/Bcl-2蛋白比值升高，P16INK4a、P27KIP表達(dá)增加，P21waf/cip1表達(dá)無明顯改變;隨著塞來昔布處理時間的延長，caspase-3蛋白、PARP蛋白逐漸出現(xiàn)裂解片斷，AIF蛋白逐漸從線粒體釋放移位到細(xì)胞核。
　　結(jié)論:
　　塞來昔布抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。塞來