基因工程融合蛋白疫苗的衍生化及肝癌轉移動物模型的建立與鑒定.pdf

1、腫瘤轉移是惡性腫瘤的生物學特征之一，也是腫瘤臨床治療的難點。據(jù)報道，60％以上的惡性腫瘤患者于初次診斷時已發(fā)現(xiàn)轉移[1]。在臨床腫瘤患者中，約有80％-90％以上死于侵襲和轉移，可以說腫瘤轉移是大多數(shù)腫瘤患者死亡的主要原因。肝細胞癌由于其組織結構的特點，容易發(fā)生早期轉移，是肝癌預后不良的原因之一。在肝細胞肝癌患者尸檢中發(fā)現(xiàn)50％-84.6％有轉移[2]。目前肝癌的治療手段主要有手術治療、放射治療、化學治療、中醫(yī)藥治療等。隨著對腫瘤免疫理

2、論的深入認識和一些新的實驗方法的涌現(xiàn)，腫瘤疫苗已成為預防和治療腫瘤轉移、復發(fā)的得力手段。黑色素瘤抗原(MelanomaAntigen，MAGE)是最先被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤特異性抗原，1991年Boon等首次發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤免疫排斥抗原－黑色素瘤相關抗原-1(Melanomaassociatedantigen-1,MAGE-1)是MAGE家族的組成成員。其廣泛表達于多種不同組織類型的腫瘤，而在除睪丸和胎盤外的正常組織中均不表達；又因MAGE-1

3、可與人類白細胞抗原(HumanLeukocytesAntigen，HLA)分子形成抗原復合物，此抗原復合物可被細胞毒T淋巴細胞(CytotoxicLymphocyte，CTL)的T細胞受體(Tcellreceptor，TCR)所識別，刺激強烈的CTL反應[3]，因此其是腫瘤特異性免疫治療理想的靶分子。熱休克蛋白(HeatShockProtein,HSP)具有分子伴侶作用，參與腫瘤抗原的加工遞呈，在誘導腫瘤免疫反應中發(fā)揮著重要作用。本實驗

4、室研究已經(jīng)表明，HSP70與MAGE1融合蛋白能提高MAGE1蛋白疫苗的免疫效果。
　　為了給MAGE1與HSP70融合蛋白基因工程納米疫苗在預防肝癌轉移方面提供合適的動物模型，本研究主要用人外周血淋巴細胞(Humanperipheralbloodlymphocyte,huPBL)和肝癌轉移細胞系97-高轉移(Metastatichepatocellularcarcinomacell97-High,MHCC97-H)建立免疫重建荷

5、人高轉移肝癌重癥聯(lián)合免疫缺陷（Severecombinedimmunodeficiency，SCID）小鼠模型，并對其進行鑒定。全文分為以下三個部分：
　　實驗一：MHCC97-Ｈ細胞中MAGE-1抗原表達的檢測
　　目的：檢測MHCC97-H細胞中MAGE-1抗原的表達情況，為MAGE-1/HSP70融合蛋白基因工程納米疫苗預防肝癌實驗提供依據(jù)。方法：用免疫組化、免疫熒光、WesternBlotting來檢測MHCC97-

6、H細胞中MAGE-1的表達情況。結果：檢測出MHCC97-H細胞中有MAGE-1抗原的表達，且免疫組化、免疫熒光、WesternBlotting的結果是相一致的。結論：MHCC97-H細胞中有MAGE-1抗原的表達，為后面的用腫瘤特異性抗原MAGE-1與熱休克蛋白HSP70融合蛋白疫苗(M1H)預防肝癌的轉移實驗提供了依據(jù)。
　　實驗二：MAGE1-HSP70融合蛋白的衍生化
　　目的：為了提高大分子蛋白的載藥量，對本實驗室

7、已經(jīng)純化的腫瘤特異性抗原M1H融合蛋白進行衍生化。方法：運用化學合成方法將腫瘤特異性抗原融合蛋白M1H與棕櫚酸交聯(lián)，使融合蛋白酯化后能更容易進行納米包裹。結果：成功制備了衍生化M1H融合蛋白。結論：衍生化M1H融合蛋白的成功制備，為下一步用納米脂質體包裹腫瘤特異性抗原MAGE-1與熱休克蛋白HSP70融合蛋白奠定了基礎。
　　實驗三：免疫重建荷人高轉移肝癌SCID鼠模型的建立及其鑒定
　　目的：建立具有人免疫學特性的高轉移肝

8、癌SCID鼠模型。方法：SCID小鼠腹腔注射人外周血淋巴細胞，皮下接種人高轉移肝癌細胞MHCC97-H，免疫重建人高轉移肝癌SCID小鼠模型，并鑒定建立的結果。結果：(1)免疫重建荷人高轉移肝癌細胞小鼠的成瘤率為100％,較荷瘤組成瘤潛伏期延長，體積縮小(p<0.05)；荷瘤組和人化荷瘤組的肝臟轉移率分別為82.5％(5/6)和67％(4/6)，人化荷瘤組從皮下轉移到肝臟所需時間較荷瘤組延長(p<0.05)。(2)第2、4、6周小鼠血中

9、人IgG含量的測定：同期相比，人化荷瘤組小鼠血中人IgG含量高于人化組(p<0.05)。(3)第6周SCID小鼠外周血中人CD3+T淋巴細胞和人CD20+B淋巴細胞含量的測定：人化荷瘤組小鼠血中人CD3+T淋巴細胞和人CD20+B淋巴細胞含量高于人化組(p<0.05)。(4)免疫組化檢測人化組和人化荷瘤組小鼠脾臟中存在人CD3+T淋巴細胞和CD20+B淋巴細胞。結論：成功建立免疫重建荷人高轉移肝癌SCID鼠模型，為肝癌轉移的研究及治療提