卵巢癌肝脾轉移動物模型的建立及轉染CD40L基因抗卵巢癌肝轉移作用的體內實驗研究.pdf

1、目的：卵巢癌是一種常見的，死亡率極高的婦科惡性腫瘤，目前主要采用手術、放療、化療相結合的治療方法，雖治療手段有了較大進步，但療效并不樂觀。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫功能低下有關，目前免疫基因治療越來越受到重視℃D40配體(CD40L)是一種免疫調節(jié)分子，CD40L與CD40結合能有效刺激T細胞增殖分化，增強其特異性殺傷腫瘤細胞的作用，還可誘導T細胞分泌細胞因子，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本課題旨在建立小鼠肝脾轉移動物模型的基礎上，探討轉染

2、CD40L基因的卵巢癌細胞株OVHM(CD40L-OVHM)脾臟接種后體內抗腫瘤效應的機制，為CD40L的臨床應用提供實驗依據。 方法： 1用MTT法測定CD40L-OVHM細胞、OVHM細胞和空載體DNA-pMKITneo-OVHM細胞的生長曲線，應用倒置顯微鏡觀察三種細胞的形態(tài)。 2用流式檢測儀檢測CD40L在CD40L-OVHM細胞和OVHM細胞的表達情況。 3用HE染色法驗證經小鼠脾內接種OVHM

3、細胞建立肝轉移模型的可行性。 4經小鼠脾臟內接種腫瘤細胞建立肝轉移模型分為四組：OVHM細胞組、空載體DNA-pMKITneo-OVHM細胞組、CD40L-OVHM細胞組及注射PBS液組。于小鼠脾臟接種腫瘤細胞后第10天用流式細胞儀分析不同組脾細胞CD11c分子的表達情況來反映樹突狀細胞(DC)的數(shù)量。于小鼠脾臟接種腫瘤細胞后第10天用MTT法檢測不同組脾臟殺傷性T細胞(CTL)的殺傷活性。于小鼠脾臟接種腫瘤細胞后第14天用EL

4、ISA法檢測不同組小鼠外周血血清中細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10和IL-12)的含量。于小鼠脾臟接種腫瘤細胞后第14天稱量小鼠肝臟和脾臟的重量及觀察肝臟轉移瘤結節(jié)的情況。最后每組余下10只小鼠用于觀察生存期。 結果： 1鏡下觀察OVHM細胞、CD40L-OVHM細胞和DNA-pMKITneo-OVHM細胞三種細胞形態(tài)無明顯區(qū)別，測定三種細胞的生長增殖情況無明顯差異。 2.CD40L-OVH

5、M細胞表面大量表達CD40L分子，而OVHM細胞未見CD40L表達。 3小鼠脾臟內接種腫瘤細胞OVHM細胞后第14天脾臟接種局部出現(xiàn)原發(fā)腫瘤，肝臟表面可見大量轉移瘤結節(jié)，病理學證實小鼠肝臟和脾臟的腫瘤結節(jié)的病理學形態(tài)結構相似，可見肝脾轉移動物模型建立成功。 4接種OVHM細胞、DNA-pMKITneo-OVHM細胞和CD40L-OVHM細胞后10天的小鼠脾細胞中CD11c陽性細胞率均明顯高于PBS對照組(P＜0.05)，

6、CD40L-OVHM細胞組小鼠的脾細胞中CD11c陽性細胞率(20.30±1.23％)與DNA-pMKITneo-OVHM細胞組和OVHM細胞組小鼠脾細胞相比較(10.69±0.89％和10.56±0.85％)有顯著性提高(P＜0.05)。 5不同組小鼠的脾臟細胞毒性T細胞(CTL)殺傷活性檢測結果顯示：CD40L-OVHM細胞組、OVHM細胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細胞組的小鼠脾細胞CTL殺傷率均高于PBS組(P

7、＜0.05)，CD40L-OVHM組對OVHM細胞的殺傷能力明顯高于OVHM組和DNA-pMKITneo-OVHM組(P＜0.05)，OVHM組和DNA-pMKITneo-OVHM組間無顯著性差異(P＞0.05)。 6 CD40L-OVHM組血清TNF-α、IL-12和IFN-γ,濃度明顯高于DNA-pMKITneo-OVHM細胞組和OVHM細胞組(P＜0.05)：CD40L-OVHM組血清IL-4和IL-10濃度明顯低于OVH

8、M組和DNA-pMKITneo-OVHM組(P＜0.05)。OVHM組和DNA-pMKITneo-OVHM組間血清TNF-α、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10濃度均無明顯差異(P＞0.05)。 7小鼠脾內接種腫瘤細胞發(fā)生肝轉移和脾臟原發(fā)瘤情況：小鼠脾臟接種腫瘤細胞后第14天，DNA-pMKITneo-OVHM細胞組和OVHM細胞組小鼠均出現(xiàn)肝轉移，脾臟均有原發(fā)瘤，肝臟平均重量分別為3.07±0.19g，3.10±0.

9、21g；脾臟平均重量分別為1.25±0.14g，1.23±0.16g，兩組之間無顯著性差異。CD40L-OVHM細胞組小鼠中有3只小鼠發(fā)生了肝轉移(3/10)，肝臟平均重量為1.45±0.14g；所有接種CD40L-OVHM細胞的小鼠脾臟均出現(xiàn)原發(fā)瘤，脾臟平均重量為0.58±0.10g。CD40L-OVHM細胞組小鼠的肝臟和脾臟重量均輕于OVHM細胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細胞組肝脾的重量(P＜0.05)，但與PBS對照組

10、相比，OVHM細胞組、DNA-pMKITneo-OVHM細胞組和CD40L-OVHM細胞組的小鼠肝臟和脾臟重量均明顯增加(P＜0.05)。 8對照組PBS組小鼠在試驗期間無一死亡，OVHM細胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細胞組的小鼠在試驗觀察期(65天)全部死亡，平均生存期分別為17±1天和18±1天；CD40L-OVHM細胞組的小鼠到實驗結束時有6只死亡，其余4只在結束實驗時仍然存活，平均生存期為58±3天，明顯長于

11、OVHM細胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細胞組(P＜0.05)。 結論： 1.通過建立小鼠肝脾轉移動物模型證實表達CD40L的OVHM細胞(CD40L-OVHM)的體內抑瘤作用明顯。 2.表達CD40L的OVHM細胞(CD40L-OVHM)能夠有效地促進脾臟DC的增殖和分化，增強脾臟細胞毒性T細胞(CTL)的特異性殺傷活性，增強機體局部抗腫瘤作用。 3.表達CD40L的OVHM細胞(CD40L-