小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)OX40L 對T細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、 小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS中最主要的免疫活性細(xì)胞，已有研究證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后是CNS內(nèi)最重要的APC,組成性低表達(dá)MHCⅡ，活化后誘導(dǎo)性高表達(dá)MHCⅡ以及CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、ICAM-1等多種免疫共刺激分子和粘附分子。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明活化后小膠質(zhì)細(xì)胞具有抗原處理、提呈功能，可再次活化T淋巴細(xì)胞。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞是最有可能參與CNS內(nèi)T細(xì)胞活化后效應(yīng)功能維持的細(xì)胞，這一過程中涉及到的CNS內(nèi)的細(xì)胞和T淋

2、巴細(xì)胞直接作用的分子機(jī)制現(xiàn)在并不確切。 T細(xì)胞活化及效應(yīng)維持不僅需要TCR與MHC-抗原肽復(fù)合物的作用，而且需要APC表達(dá)共刺激分子提供輔助信號。缺乏共刺激信號時(shí)，識別抗原后的T細(xì)胞會失能或死亡。在初始T細(xì)胞的活化階段，最早被深入研究的CD28、CD40L共刺激信號發(fā)揮重要作用，而在效應(yīng)和記憶T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持階段大部分CD4+和CD8+T細(xì)胞并不依賴這兩條共刺激信號通路，還存在其它多種免疫分子參與調(diào)節(jié)活化后T細(xì)胞功能。其中

3、，共刺激分子對OX40-OX40L主要作用在效應(yīng)T細(xì)胞的晚期應(yīng)答階段。OX40在T細(xì)胞活化后期表達(dá)，相類似地，其配體OX40L也在樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等APC活化后誘導(dǎo)表達(dá)，對促進(jìn)T細(xì)胞的存活、增殖、細(xì)胞因子的釋放和記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。OX40缺陷的T細(xì)胞在TCR作用后早期無明顯異常，但在T細(xì)胞活化后5-6天出現(xiàn)顯著的增殖抑制和細(xì)胞死亡。 基于以上認(rèn)識，針對C

4、NS內(nèi)T細(xì)胞活化后效應(yīng)維持的分子機(jī)制，我們推測：小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS內(nèi)最重要的APC,很有可能通過免疫共刺激分子OX40-OX40L在其中起重要作用。 目的：觀察小膠質(zhì)細(xì)胞OX40L的表達(dá)以及LPS、IFN-γ刺激后的表達(dá)情況；了解小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)OX40L對活化后T細(xì)胞增殖和凋亡的影響。探討OX40-OX40L信號分子在小膠質(zhì)細(xì)胞對T細(xì)胞活化后免疫效應(yīng)維持中的作用及機(jī)理，對深入認(rèn)識CNS內(nèi)T細(xì)胞免疫應(yīng)答過程及防治相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)

5、依據(jù)。 方法：培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株N9用LPS(500ng/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)刺激后，檢測m-TNF-α和NO含量，確定N9活化情況。采用RT-PCR、FACS方法檢測不同時(shí)相點(diǎn)N9活化前后免疫共刺激分子OX40L的表達(dá)變化，并比較不同劑量的LPS、m-IFN-γ單獨(dú)和協(xié)同刺激N9時(shí)與OX40L表達(dá)的量效關(guān)系。免疫熒光定位檢測OX40L表達(dá)。 分離新生小鼠大腦皮層的小膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)、形

6、態(tài)特征及細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測細(xì)胞膜上特異性抗原(GSA-IB4)鑒定分離細(xì)胞的純度。LPS(500ng/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)協(xié)同刺激原代小膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測細(xì)胞活化前后OX40L的表達(dá)變化。 密度梯度離心法和尼龍毛法分離小鼠脾臟T細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測純度，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。用ConA(5μg/ml)活化T細(xì)胞后FACS檢測OX40表達(dá)。 將活化后OX40L+的N9經(jīng)60Co30Gy輻照，

7、與活化后OX40+的T細(xì)胞共培養(yǎng)，并設(shè)立阻斷組(加入OX40L單克隆抗體)特異性阻斷OX40-OX40L信號后，[3H]-TdR摻入實(shí)驗(yàn)測定T細(xì)胞增殖，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI熒光染色后FACS方法檢測T細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株N9活化前在mRNA和蛋白水平有OX40L組成性低表達(dá)。經(jīng)LPS(500ng/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)活化后表達(dá)顯著提高。在表達(dá)時(shí)相上，與N9活化早期12h以內(nèi)上調(diào)表達(dá)的

8、分子MHCⅡ及免疫共刺激分子CD80、CD86、CD40相比，OX40L的表達(dá)較晚，F(xiàn)ACS結(jié)果顯示，OX40L在活化后24h表達(dá)明顯升高。 用不同劑量的LPS和m-IFN-γ活化N9后顯示，OX40L的表達(dá)水平與刺激劑量呈現(xiàn)量效關(guān)系。LPS與m-IFN-γ共同刺激時(shí)對誘導(dǎo)OX40L表達(dá)有協(xié)同效應(yīng)。 免疫熒光結(jié)果證實(shí)OX40L表達(dá)于N9細(xì)胞膜表面。 原代小膠質(zhì)細(xì)胞活化前無OX40L表達(dá)，活化后有陽性表達(dá)。

9、 活化后小膠質(zhì)細(xì)胞上OX40L的表達(dá)可明顯增強(qiáng)活化后T細(xì)胞增殖，抑制T細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：本研究在體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞株N9和原代小膠質(zhì)細(xì)胞上，首次發(fā)現(xiàn)活化后小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面表達(dá)免疫共刺激分子OX40L，并初步證實(shí)該分子可通過結(jié)合并激活T細(xì)胞上的OX40信號，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，其機(jī)制之一為抑制T細(xì)胞凋亡，從而可能在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于有助于揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有細(xì)胞直接參與T細(xì)胞效