博爾納病病毒對(duì)人少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡影響的初步研究.pdf

1、背景及目的：
　　博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)是一種非細(xì)胞毒性的、單股負(fù)鏈的RNA病毒，具有高度嗜神經(jīng)細(xì)胞特性，能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)病毒感染，BDV宿主范圍很廣，據(jù)報(bào)道可引起鼠、馬、兔、狗等多種溫血類動(dòng)物的自然感染或?qū)嶒?yàn)室感染，并表現(xiàn)出以明顯的精神、行為異常等為特征的神經(jīng)精神臨床癥狀。同時(shí)，大量國(guó)內(nèi)外的的流行病學(xué)調(diào)查顯示BDV感染可能與人類某些精神神經(jīng)疾病的發(fā)生有一定聯(lián)系，BDV能感染神經(jīng)元和神

2、經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，引起神經(jīng)細(xì)胞可塑性、代謝分泌功能改變，但感染具體機(jī)制研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，其中BDV對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的感染機(jī)制研究更為少見(jiàn)。
　　本研究通過(guò)BDV實(shí)驗(yàn)感染人少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte cells，OL cells)，針對(duì)血清濃度單因素改變對(duì)BDV病毒滴度結(jié)果的影響進(jìn)行比較，探討選擇BDV感染細(xì)胞適宜的血清濃度，以進(jìn)一步開(kāi)展BDV感染神經(jīng)細(xì)胞研究，另一方面在最適宜血清濃度培養(yǎng)條件下用病毒感染細(xì)胞，觀察其對(duì)O

3、L細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)和凋亡的影響，并探討病毒致病相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、復(fù)蘇OL/BDV3660株細(xì)胞，通過(guò)反復(fù)凍融方式獲取病毒液。將OL細(xì)胞在含不同濃度FBS的DMEM液條件下進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)制備不同稀釋倍數(shù)的病毒液，依次用不同稀釋濃度的病毒液感染細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)7日后，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)病毒陽(yáng)性細(xì)胞集落數(shù)，計(jì)算出最適合該病毒感染少突膠質(zhì)細(xì)胞的血清濃度。
　　2、培養(yǎng)OL細(xì)胞，加入BDV病毒液感染OL細(xì)胞，通過(guò)

4、BDV核蛋白免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定BDV感染是否成功，以建立BDV感染的OL細(xì)胞模型。
　　3、采用CCK8試劑盒，分別測(cè)定BDV感染OL細(xì)胞1～7天的生長(zhǎng)增殖情況，繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)采用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定BDV感染OL細(xì)胞24內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞周期各期的DNA含量，觀察感染對(duì)增殖能力的影響。收集BDV感染1、3、5天的OL細(xì)胞，采用流式細(xì)胞技術(shù)，測(cè)定凋亡細(xì)胞數(shù)目。
　　4、培養(yǎng)細(xì)胞，分別提取BDV感染1、3、5天的OL細(xì)胞蛋白，采

5、用Western-blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)Bcl-2、Bax的蛋白相對(duì)表達(dá)量變化。
　　結(jié)果：
　　1、病毒滴度測(cè)定后顯示，在2％FBS培養(yǎng)條件下，病毒滴度測(cè)定值相比其它幾種培養(yǎng)條件更高。
　　2、通過(guò)免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)，BDV感染OL細(xì)胞3天和5天時(shí)，均可發(fā)現(xiàn)P40蛋白綠色熒光表達(dá)，說(shuō)明BDV感染OL細(xì)胞成功。
　　3、通過(guò)CCK8試劑盒測(cè)定OL細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，BDV感染細(xì)胞7天內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞的數(shù)

6、量逐漸增多。但與對(duì)照組OL細(xì)胞相比，感染組細(xì)胞的增殖能力明顯更低(P<0.05)。
　　4、采用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定BDV感染OL細(xì)胞24小時(shí)內(nèi)的周期變化發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)胞周期G2期延遲，細(xì)胞增殖指數(shù)降低。采用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定凋亡細(xì)胞數(shù)目發(fā)現(xiàn)，在BDV感染OL細(xì)胞3天和5天時(shí)，感染組檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)。
　　5、采用Western-blot免疫印跡方法檢測(cè)凋亡相關(guān)標(biāo)志物Bcl-2、Bax的蛋白相對(duì)表

7、達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在感染3天和感染5天時(shí)，感染組細(xì)胞的促凋亡標(biāo)志Bax的蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞；而感染組細(xì)胞抑凋亡標(biāo)志Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、不同濃度血清的病毒培養(yǎng)條件可影響B(tài)DV對(duì)細(xì)胞的感染力，2％FBS的培養(yǎng)條件可能更適合于BDV感染OL細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　2、BDV感染可以抑制OL細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，并可能通過(guò)上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而參與誘導(dǎo)細(xì)胞