一種新型造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子EDAG-1的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、紅系發(fā)育相關(guān)基因(erythoid develop associated gene，EDAG-1)是一種特異表達(dá)于造血組織和細(xì)胞的新基因(中國專利申請?zhí)枺?1118268.8公開號：CN1388130A)，它在造血發(fā)育與分化調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步研究EDAG-1調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的分子機制，及探討其臨床潛在應(yīng)用前景，研制EDAG-1的單克隆抗體是十分必要的。本實驗用原核表達(dá)的方式獲得足夠的純化EDAG-1重組蛋白為抗原，

2、通過細(xì)胞融合技術(shù)制備EDAG-1單克隆抗體，為EDAG-1的深入研究提供可能。 本實驗選用pGEX-4T-3載體，成功構(gòu)建了含GST標(biāo)簽的pGEX-4T-3-EDAG-1原核表達(dá)載體，經(jīng)過對表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化，在37℃培養(yǎng)，OD<,600>為1.4-1.5時加0.1-mM IPTG誘導(dǎo)4小時，可以獲得較高效率的GST-EDAG-1融合蛋白表達(dá)，融合蛋白占菌體可溶蛋白的30％以上，并且表達(dá)的蛋白以可溶性形式存在于菌體中。迎過對誘導(dǎo)蛋

3、白的純化，可以獲得較高純度的EDAG-1蛋白。 利用原核表達(dá)獲得的GST-EDAG-1融合蛋白對BALB/C小鼠進(jìn)行免疫，將免疫后小鼠的脾臟細(xì)胞和來源于同種系小鼠的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型和胸腺核苷激酶缺陷型)采用PEG介導(dǎo)的融合方式進(jìn)行細(xì)胞融合實驗，通過HAT培養(yǎng)基對融合細(xì)胞進(jìn)行初步篩選，進(jìn)而通過ELISA實驗對所獲得雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行抗體表達(dá)驗證，獲得表達(dá)EDAG-1抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞。通過對