人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(hMIF)是一種重要的免疫調(diào)控細(xì)胞因子，組成性表達(dá)于全身多種組織，其主要來(lái)源是垂體前葉細(xì)胞、活化的T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等。hMIF基因編碼區(qū)含353bp，編碼由¨5個(gè)氨基酸殘基組成、分子量約為12.5kD的非糖基化蛋白。除細(xì)胞因子的基本功能外，hMIF還具有類似激素、生長(zhǎng)因子、應(yīng)激反應(yīng)蛋白及糖基化抑制因子(glycosylatedinhibitoryfactors,GIF)等的多重作用，并可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答

2、。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，hMIF可促進(jìn)感染性休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等感染性、自體免疫性疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，hMIF還可加速創(chuàng)傷后的組織修復(fù)。故本文hMIF的原核表達(dá)和抗hMIF單克隆抗體的制備研究將為上述疾病的診斷和治療提供新的機(jī)遇。 主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果：1.hMIF基因的克隆和原核表達(dá) (1)根據(jù)GenBank發(fā)表的hMIFcDNA序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物，經(jīng)RT-PCR從人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB453和人乳腺

3、癌組織擴(kuò)增hMIFcDNA，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出全長(zhǎng)為353bp的hMIF基因片段；凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET11b中，測(cè)序表明所克隆到的hMIF序列與GenBank發(fā)表的hMIFcDNA序列完全一致。 (2)重組質(zhì)粒pET11b/hMIF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，按IPTG的作用時(shí)間分組誘導(dǎo)hMIF蛋白的表達(dá)；TricineSDS-PAGE可見(jiàn)，與未誘導(dǎo)組相比，IPTG誘導(dǎo)組細(xì)菌有一條

4、分子量約為12.5kD的特異蛋白條帶，與hMIF蛋白的預(yù)計(jì)分子量相符；誘導(dǎo)6h時(shí)蛋白表達(dá)量最高，約占細(xì)菌總蛋白的30％。將表達(dá)菌破菌離心后分別取細(xì)菌上清和沉淀電泳，證實(shí)該蛋白為可溶性表達(dá)。 (3)將BL21重組菌(pET11b/hMIF)誘導(dǎo)發(fā)酵，超聲破菌；1g濕菌經(jīng)陽(yáng)離子交換和疏水層析可得到約53mg純度為95.40％的hMIF，得率約為17.7％，純化的蛋白濃度為1.145g/L，Westernblotting結(jié)果表明純化的

5、hMIF蛋白能與鼠抗hMIF單克隆抗體形成特異性條帶。 2.抗hMIF單克隆抗體的制備 (1)用純化的hMIF蛋白免疫Balb/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)經(jīng)5次細(xì)胞融合，利用間接ELISA法和克隆化篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗hMIF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株hMIF-A2、hMIF-D5，其細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)分別達(dá)1：3200和1：6400。 (2)2株雜交瘤細(xì)胞核型分析發(fā)現(xiàn)，染色體數(shù)目在80～102之間，同時(shí)含有端著絲粒