大鼠腎移植術(shù)后腎小球的比較蛋白組學(xué)研究.pdf

1、目的：利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析大鼠同系移植組和同種異基因移植組腎移植術(shù)后腎小球蛋白質(zhì)組差異表達(dá)情況，尋找移植腎急性排斥反應(yīng)相關(guān)的蛋白標(biāo)志物。 方法：1.建立大鼠腎移植模型：改良Fisher等建立的經(jīng)典大鼠腎移植模型方法，進(jìn)行大鼠腹腔原位腎移植手術(shù)；2。實(shí)驗(yàn)動物分組：(1)同系移植組(10只)：供、受者均為雄性Sprague-Dawely(SD)大鼠；(2)同種異基因移植組(10只)：供者為雄性SD大鼠，受者為雄性Wistar大鼠。

2、實(shí)驗(yàn)大鼠于造模后第3d(每組5只)和第5d(每組5只)麻醉后取移植腎臟，移植腎標(biāo)本分為兩部分，一部分作病理學(xué)檢測；另一部分用來分離腎小球進(jìn)行比較蛋白組學(xué)研究；3.移植腎臟病理學(xué)檢測：采用國際公認(rèn)的Banff標(biāo)準(zhǔn)對移植腎臟排斥反應(yīng)病理學(xué)改變程度進(jìn)行分級評分；4.同系移植組和同種異基因移植組腎小球差異表達(dá)蛋白的鑒定：采用2-DE聯(lián)合MS技術(shù)路線分離、鑒定移植。腎急性排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白，即利用固相pH梯度(Immobilized pH grad

3、ient，IPG)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)分離大鼠腎移植術(shù)后3d的腎小球蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色后經(jīng)PDQuest7.0軟件進(jìn)行圖像分析識別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，將增強(qiáng)表達(dá)的10個蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切后，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass s

4、pectrometry，MALDI-TOF-MS)分析獲得差異表達(dá)蛋白的肽指紋圖譜，并用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索、分析確定差異表達(dá)的蛋白；5.選2種差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行組織定位驗(yàn)證：采用免疫組織化學(xué)方法對差異表達(dá)的蛋白的分布和表達(dá)量進(jìn)行初步驗(yàn)證，并分析與相同時間點(diǎn)(3d、5d)腎移植急性排斥反應(yīng)病理學(xué)改變的相關(guān)性；6.血清中該可溶性差異表達(dá)蛋白的檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法進(jìn)行檢測。 結(jié)果：1

5、.成功建立大鼠腹腔原位腎移植模型，供腎與受體鼠動靜脈吻合時間40±10min，總手術(shù)時間110±20min。2.移植腎臟病理學(xué)改變：同系移植組術(shù)后第3d，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)、形態(tài)基本正常，偶有散在的間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤；術(shù)后第5d，炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量未見增多，范圍未見明顯擴(kuò)大；同種異基因移植組術(shù)后第3d，腎小球旁及小動脈周淋巴細(xì)胞浸潤，腎小管間質(zhì)散在淋巴細(xì)胞浸潤，腎小球細(xì)胞數(shù)增多：術(shù)后第5d，腎小球內(nèi)炎性細(xì)胞沿球囊向球內(nèi)浸潤，小動脈內(nèi)皮細(xì)胞脫

6、落、出血、血栓形成，亦可見小動脈壁纖維素樣壞死，腎間質(zhì)彌漫性炎細(xì)胞浸潤，腎小管細(xì)胞變性、壞死；3.同系移植組和同種異基因移植組腎小球差異表達(dá)蛋白的鑒定結(jié)果：(1)得到了分辨率較高、重復(fù)性較好的同系移植組和同種異基因移植組的術(shù)后第3d的腎小球蛋白雙向凝膠電泳圖譜(17cm IPG膠條pH 3-10)；(2)比較分析同系移植組和同種異基因移植組移植后腎小球雙向凝膠電泳圖譜，找到差異蛋白質(zhì)點(diǎn)24個(6個點(diǎn)表達(dá)降低，18個點(diǎn)表達(dá)增高)；(3)對

7、其中10個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprint，PMF)分析，獲得了8個差異表達(dá)蛋白的肽指紋圖譜；經(jīng)生物信息學(xué)方法分析確定了5種差異(增強(qiáng))表達(dá)的蛋白：電壓依賴性陰離子通道，3-磷酸甘油醛脫氫酶，Cofilin，CD44和熱休克蛋白90(Heat shock protein 90，HSP90)。4.CD44和熱休克蛋白90(Heat shock protein 90，HSP90)在移植。腎組織的

8、表達(dá)：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，同系移植組未見血管內(nèi)皮表達(dá)CD44，移植腎皮質(zhì)僅包曼氏囊壁層上皮細(xì)胞、腎小管及其間質(zhì)少量表達(dá)CD44分子，同種異基因移植組移植腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的。腎小球、小血管內(nèi)皮、腎小管和間質(zhì)均高表達(dá)CD44分子；同系移植組移植腎組織腎小管和。腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞微弱表達(dá)HSP90；同種異基因移植組移植腎小血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球強(qiáng)烈表達(dá)HSP90，且表達(dá)量與移植腎組織病理學(xué)損害程度相關(guān)；5.血清CD44和HSP90水平：E

9、LISA結(jié)果顯示同種異基因移植組術(shù)后第3d和第5d的血清CD44和HSP90水平較同系移植組明顯升高(P＜0.05)，同種異基因移植組術(shù)后第5d組血清CD44水平雖高于第3d組，但差異不顯著(P＞0.05)；同種異基因移植組術(shù)后第5d組血清HSP90水平明顯高于3d組(P＜0.05)。 結(jié)論：發(fā)現(xiàn)大鼠腎移植急性排斥時腎小球差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)有24個，其中6個點(diǎn)表達(dá)降低1 8個點(diǎn)表達(dá)增高，經(jīng)肽指紋圖譜鑒定和Mascot軟件在NCBI

10、nr數(shù)據(jù)庫中分析后確定了5種腎移植急性排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白，從中選出的CD44和HSP90經(jīng)免疫組織化學(xué)方法驗(yàn)證在急性排斥反應(yīng)早期(術(shù)后第3d)即可高表達(dá)于腎小球，且HSP90表達(dá)量與腎移植排斥反應(yīng)病理損害程度相關(guān)，同種異基因移植組血清CD44和HSP90水平也較同系移植組明顯升高，因此，初步確定CD44和HSP90為腎移植急性排斥反應(yīng)的候選標(biāo)志蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為CD44和HSP90作為監(jiān)測指標(biāo)用于腎移植急性排斥反應(yīng)的診斷研究提供了理論和實(shí)