DPPⅣ酶抑制減輕大鼠肺移植缺血再灌注損傷的差異蛋白組學(xué)研究.pdf

1、背景：肺移植（LT）是當(dāng)前治療終末期肺部疾病的唯一有效方法，自1983年第一例成功的臨床異體肺移植完成，二十多年來，肺移植技術(shù)越來越多的運用于臨床并取得了長足的發(fā)展?，F(xiàn)全球每年肺移植數(shù)量超過2000例，截止至2010年，全球158個中心行各類肺移植術(shù)共32652例，平均中位生存期5.3年，五年生存率達(dá)到了52％，十年生存率達(dá)29％。肺移植的生存率隨著各種肺保護(hù)技術(shù)，抗排斥反應(yīng)技術(shù)，及綜合學(xué)科技術(shù)的進(jìn)步逐漸提高。
　　 然而，圍手

2、術(shù)期死亡仍然是造成肺移植失敗的一個主要因素，據(jù)統(tǒng)計，肺移植圍手術(shù)期死亡的主要原因是肺缺血再灌注損傷（I/RInjury）引起的原發(fā)性移植物功能障礙（PGD）。盡管手術(shù)技術(shù)、肺保護(hù)技術(shù)、重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)不斷提高，肺缺血再灌注損傷誘發(fā)的原發(fā)性移植物功能障礙仍然是肺移植早期死亡的主要病因。發(fā)生在移植術(shù)后72小時內(nèi)的非特異性肺泡及間質(zhì)損傷、肺水腫、低氧血癥是肺缺血再灌注損傷的主要表現(xiàn)。過去的20年，缺血再灌注損傷的機制越來越清楚地被闡明，新型肺保護(hù)

3、液及肺保護(hù)技術(shù)的運用使得原發(fā)性移植物功能障礙的發(fā)生率從90年代初的30％降低至目前的12％左右。然而，肺組織相對于其他實質(zhì)性臟器有其自有的生理特性，肺組織對缺血及其他外源性環(huán)境刺激更為敏感，供肺的獲取與保護(hù)較其他實質(zhì)性臟器更為嚴(yán)格。真正適合作為供肺的來源的器官數(shù)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于諸如肝，腎，心等實質(zhì)性臟器。據(jù)統(tǒng)計，約3/4的終末期肺部疾病患者在等待合適的供體的過程中就已死亡，開發(fā)新型的具有保護(hù)甚至恢復(fù)作用的肺保存藥物可以減輕移植術(shù)后缺血再灌注

4、損傷的發(fā)生率，并擴大供肺的獲取來源，具有十分重要的臨床意義。
　　 T 淋巴細(xì)胞表面分化抗原CD26/DPPⅣ是一個相對分子質(zhì)量為110kDa的多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，其具有二酰二肽酶活性，并在多種細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等表面表達(dá)，其在肺組織中也發(fā)現(xiàn)了較高的表達(dá)。之前我們的研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制供肺二肽酰肽酶Ⅳ（DPPⅣ酶）的活性能夠明顯地減輕大鼠移植肺的I/R 損傷，并在短期內(nèi)（2 h）達(dá)到改善移植肺功能（pulm

5、onary function）的作用。然而抑制供肺DPPⅣ酶活性對術(shù)后較長時間段肺功能的影響以及其減輕移植肺I/R 損傷的具體機制尚不清楚，推測可能與CD26/DPPⅣ對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其底物對肺功能的保護(hù)作用有關(guān)。本實驗旨在探討抑制供肺DPPⅣ酶活性對大鼠肺移植術(shù)后較長時間段肺功能的影響，并運用差異蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）技術(shù)找出供肺DPPⅣ酶抑制后肺組織的差異蛋白表達(dá)，探究DPPⅣ酶活性減輕肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷的機

6、制。
　　 目的：建立大鼠原位異體肺移植模型（rat lung transplantation model），研究供肺DPPⅣ酶活性抑制對大鼠肺移植術(shù)后較長時間段內(nèi)(7d)肺功能的影響，并運用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)找出供肺DPPⅣ酶抑制后(1d)肺組織的差異蛋白表達(dá)，探究DPPⅣ酶活性抑制減輕肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷的機制。
　　 方法：以SD 大鼠作為試驗動物，運用改良的三套管法建立大鼠原位異體左肺移植模型。運用DPPⅣ酶

7、特異性抑制劑AB192 灌注并保存供肺18h后行移植術(shù)，觀察其對肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷及長期肺功能的影響。將運用AB192 灌注保存的進(jìn)行肺組織與對照組供肺行蛋白組學(xué)研究，即利用雙向凝膠電泳（2D-PAGE）分離兩組總蛋白，通過圖像分析尋找表達(dá)差異的蛋白點，對其進(jìn)行MALDI-TOF 質(zhì)譜分析。對經(jīng)質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)ATⅢ應(yīng)用酶聯(lián)免疫法對其含量進(jìn)行鑒定，研究并驗證其對肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：建立了穩(wěn)定大鼠原位肺

8、移植模型。對照組大鼠至術(shù)后第7天全部死亡，實驗組（DPPⅣ酶特異性抑制組）的大鼠均存活至術(shù)后第7天。與對照組比較，各實驗組的PIP 值降低，PO2 值升高，W/D 值降低，MPO 活性及MDA 含量降低，并且隨著時間的推移，實驗組的上述指標(biāo)不斷改善，至術(shù)后第7天，各項檢測值接近正常。運用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)找出供肺DPPⅣ酶抑制后肺組織的差異蛋白表達(dá)，比較術(shù)后第1d 兩組供肺組織2D-PAGE 圖譜，得到差異蛋白點87個。對其中15個差異

9、蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖分析，鑒定出多個差異蛋白。其中9個差異蛋白均在實驗組中過表達(dá)，而在對照組組織中低表達(dá)或不表達(dá)，6個在對照組中過表達(dá)。發(fā)現(xiàn)ATⅢ對肺組織缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：特異性的DPPⅣ酶抑制能夠明顯的減輕大鼠肺移植術(shù)后移植肺的缺血再灌注損傷，并有促進(jìn)肺功能恢復(fù)作用。通過2-DE 蛋白電泳成功的建立了大鼠肺組織2-DE 圖譜，并發(fā)現(xiàn)了多個差異蛋白表達(dá)，鑒定了其中15個蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)了多個對肺功能有保護(hù)