線粒體功能與卵母細(xì)胞體外成熟、受精及發(fā)育潛能的關(guān)系研究.pdf

1、本研究分為兩部分。
　　第一部分.控制性超促排卵(COH)和體外成熟(IVM)過程對卵母細(xì)胞線粒體的功能與分布影響的研究
　　 目的：
　　 過高的卵子損失率仍是當(dāng)前人類輔助生殖技術(shù)(ART)所面臨的最大問題。細(xì)胞質(zhì)成熟是卵子正常受精和發(fā)育的關(guān)鍵，細(xì)胞質(zhì)成熟不全或滯后于核的成熟被認(rèn)為是ART周期卵子發(fā)育潛能低下的重要原因。在卵子成熟過程中，胞漿中線粒體發(fā)生了劇烈變化，正常的線粒體結(jié)構(gòu)和功能狀況是細(xì)胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。

2、ART周期中，控制性超促排卵(COH)和卵子體外成熟(IVM)過程恰好與胞漿線粒體急劇變化的時期相重合。那么，COH和IVM這兩個非生理性卵子成熟過程是否會對卵子線粒體的功能狀況產(chǎn)生影響，進(jìn)而干擾細(xì)胞質(zhì)成熟進(jìn)程?以及COH/IVM過程對卵子線粒體功能狀況的影響是否就是造成ART周期卵子高損失率或低發(fā)育潛能的重要原因?對此，本研究以小鼠為動物模型，模擬人類COH和IVM周期操作，通過分析成熟卵子線粒體的空間分布、DNA(mtDNA)拷貝數(shù)

3、、氧化磷酸化(OXPHOS)功能，以及與線粒體功能密切相關(guān)的活性氧(ROS)水平和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)完整性，來評估非生理性COH/IVM過程對線粒體的數(shù)量、功能、分布及卵子質(zhì)量的影響，為探索人類ART周期卵子低發(fā)育潛能和高損失率的機(jī)制提供新的思路。
　　 方法：
　　 將實驗小鼠隨機(jī)分為控制性超促排卵(COH)、體外成熟(IVM)和自然周期(NC)對照三個小組。小鼠COH和IVM培養(yǎng)過程盡量參照人ART周期中相應(yīng)的操作方案。收

4、集各組成熟卵子，分別檢測mtDNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位強度、ATP含量、線粒體分布、ROS水平及紡錘體與染色體結(jié)構(gòu)正常率，以評估COH和IVM這兩個常用ART方案對線粒體的功能狀況和卵子質(zhì)量的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.在COH組和NC組卵子之間，除線粒體分布和ROS水平以外，所有其它檢測指標(biāo)均存在著顯著差異，即COH組卵子的平均mtDNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位強度、ATP含量和紡錘體與染色體結(jié)構(gòu)正常率均顯著低于NC組

5、卵子的相應(yīng)指標(biāo)(P<0.05)。
　　 2.在IVM組與NC組卵子之間，mtDNA拷貝數(shù)、ROS水平和紡錘體與染色體結(jié)構(gòu)正常率存在著顯著差異，即IVM組卵子mtDNA拷貝數(shù)和紡錘體與染色體結(jié)構(gòu)的正常率顯著低于NC組卵子的(P<0.05)，而IVM組的胞漿總ROS水平和線粒體特異性ROS水平顯著高于NC組的(P<0.05)。線粒體膜電位、ATP含量和線粒體分布在IVM組與NC組之間，無顯著意義的差別(P>0.05)。
　　

6、 結(jié)論：
　　 1.非生理性COH和IVM過程可顯著影響卵子線粒體的功能，以及與之密切相關(guān)的ROS水平和紡錘體/染色體結(jié)構(gòu)，繼而可能影響卵子細(xì)胞質(zhì)的成熟進(jìn)程。
　　 2.外源Gn刺激會顯著降低COH組卵子的mtDNA的拷貝數(shù)、線粒體膜電位強度、ATP含量和紡錘體/染色體結(jié)構(gòu)正常率。
　　 3.IVM過程會顯著降低卵子的mtDNA拷貝數(shù)和紡錘體/染色體結(jié)構(gòu)正常率，并且還會顯著增加ROS的生成。但I(xiàn)VM過程對線粒體膜

7、電位強度和ATP含量沒有顯著意義的影響。
　　 4.需要進(jìn)一步的研究以分析線粒體功能狀況影響卵子成熟、受精和發(fā)育的具體效應(yīng)和機(jī)制。
　　 第二部分卵母細(xì)胞成熟過程中線粒體的氧化磷酸化和DNA復(fù)制功能對卵母細(xì)胞質(zhì)量及發(fā)育潛能影響的研究
　　 在卵母細(xì)胞成熟過程中，胞漿中線粒體發(fā)生了劇烈變化，而線粒體的功能被證實與卵母細(xì)胞的成熟、受精和發(fā)育潛能密切相關(guān)。但迄今為止，對于線粒體是以何種機(jī)制影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量和發(fā)育潛能仍

8、存在著爭議。有研究認(rèn)為，線粒體的數(shù)量或DNA(mtDNA)拷貝數(shù)是影響卵母細(xì)胞成熟、受精和發(fā)育潛能的關(guān)鍵；另有研究則認(rèn)為，氧化磷酸化(OXPHOS)功能才是線粒體影響卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育潛能的主要機(jī)制。
　　 目的：
　　 在卵母細(xì)胞成熟過程中，采用獨立的線粒體功能抑制劑分別抑制線粒體的OXPHOS功能和DNA復(fù)制功能，建立線粒體功能抑制模型，分析線粒體功能抑制對卵母細(xì)胞成熟、質(zhì)量、受精和發(fā)育潛能的影響，以明確線

9、粒體對卵母細(xì)胞的影響的機(jī)制。
　　 方法：
　　 在小鼠體外成熟培養(yǎng)液中引入不同濃度的羰基氰4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP，10和100nM)或2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC，10和100μM)，分別抑制線粒體的OXPHOS功能和DNA復(fù)制功能。經(jīng)體外14小時成熟培養(yǎng)，收集卵母細(xì)胞，檢測各組成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位強度和ATP含量，以評估FCCP和ddC線粒體功能抑制模型的效果。統(tǒng)計卵母細(xì)胞的生發(fā)泡

10、破裂(GVBD)發(fā)生率和細(xì)胞核成熟率，分析線粒體功能抑制對卵母細(xì)胞體外成熟的影響，并通過卵母細(xì)胞線粒體的空間分布、ROS水平、紡錘體和染色體結(jié)構(gòu)來評估線粒體功能抑制對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響。最后，統(tǒng)計分析卵母細(xì)胞體外受精率、囊胚形成率及擴(kuò)張期囊胚總細(xì)胞計數(shù)，以評估線粒體功能抑制對卵母細(xì)胞受精能力和胚胎發(fā)育潛能的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、體外添加FCCP可有效降低卵母細(xì)胞的線粒體膜電位和ATP含量(P<0.05)，但對m

11、tDNA拷貝數(shù)無顯著意義的影響(P>0.05)；添加ddC可以使卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)降低約50％(P<0.05)，但對線粒體膜電位和ATP含量沒有顯著意義的影響(P>0.05)。
　　 2、FCCP處理組和ddC處理組的GVBD發(fā)生率與對照組的相比，均無顯著意義的差異(P>0.05)。FCCP的10和100 nM兩濃度處理組的細(xì)胞核成熟率分別為55.8％和47.3％，顯著低于對照組的62.9％(P<0.05)；ddC兩處理

12、組的細(xì)胞核成熟率與對照組的相比，無顯著意義的差異(P>0.05)。
　　 3、FCCP的10和100 nM處理組，線粒體呈均勻分布的卵母細(xì)胞的比例分別為66.2％和54.4％，均顯著低于對照組的78.2％(P<0.05)；ddC兩處理組線粒體呈均勻分布的比例與對照組相比，無顯著意義的差異(P>0.05)。
　　 4、除FCCP100 nM處理組的紡錘體結(jié)構(gòu)正常率(SP)外，F(xiàn)CCP處理組卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體結(jié)構(gòu)的其它

13、檢測指標(biāo)均顯著低于對照組(P<0.05)；除ddC10μM-組的紡錘體結(jié)構(gòu)正常率(SP)和染色體正常率(CS)外，ddC處理組紡錘體和染色體結(jié)構(gòu)其它檢測指標(biāo)均顯著低于對照組(P<0.05)。
　　 5、FCCP兩濃度處理組的胞漿總ROS水平和線粒體特異性ROS水平均顯著低于對照組的(P<0.05)；ddC處理組的卵母細(xì)胞ROS水平也有所下降，但與對照組相比，無顯著意義的差異(P>0.05)。
　　 6、FCCP和ddC處

14、理對卵母細(xì)胞的體外受精能力均沒有顯著意義的影響(P>0.05)。
　　 7、FCCP的10和100nM兩處理組的囊胚形成率分別為57.8％和41.9％，ddC10和100μM兩處理組的囊胚形成率分別為46.6％和37.6％，F(xiàn)CCP和ddC各濃度處理組的囊胚形成率均顯著低于對照組的68.1％(P<0.05)，但各組擴(kuò)張期囊胚的總細(xì)胞數(shù)目間無顯著意義的差別(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.線粒體的OXPH

15、OS功能和DNA復(fù)制功能抑制對卵母細(xì)胞的成熟、質(zhì)量和發(fā)育均具有嚴(yán)重的影響，但兩者對卵母細(xì)胞所產(chǎn)生的效應(yīng)并不相同。
　　 2.線粒體的OXPHOS功能抑制對卵母細(xì)胞的核成熟、線粒體的空間分布、紡錘體/染色體結(jié)構(gòu)及胚胎發(fā)育潛能均產(chǎn)生了不利影響，但對卵母細(xì)胞的成熟啟動和體外受精能力沒有直接影響。
　　 3.線粒體DNA復(fù)制功能抑制主要對遠(yuǎn)期的胚胎發(fā)育潛能產(chǎn)生影響，但對卵母細(xì)胞體外成熟、線粒體分布、ROS生成和受精能力沒有顯著意