髓樣細胞分化蛋白抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的機制研究.pdf

1、固有免疫是機體抗病毒的第一道防線,在機體被病毒感染后通過模式識別相關(guān)受體(pattern recognition receptors(PRRs))識別病毒的不同成分從而啟動固有免疫系統(tǒng),在感染發(fā)生的幾分鐘內(nèi)受體識別這些病原體后激活固有免疫系統(tǒng),產(chǎn)生前炎癥因子抗菌肽和Ⅰ型干擾素。Ⅰ型干擾素會以自分泌和旁分泌的形式與受體結(jié)合并激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。信號通路激活后,干擾素誘導(dǎo)基因(ISG)的表達上調(diào)。干擾素誘導(dǎo)基因(ISG)是固有免疫抗病毒和抗腫

2、瘤作用的主要效應(yīng)分子。干擾素是固有抗病毒的免疫的核心效應(yīng)分子。重組α-干擾素已經(jīng)被應(yīng)用到臨床的抗病毒治療。
　　 乙型肝炎病毒(HBV)是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒,它的復(fù)制需經(jīng)過一個逆轉(zhuǎn)錄的過程,并可整合到宿主細胞基因組中,引起非細胞病變性感染。在全球范圍內(nèi)有4億感染者,對人類健康造成極大的危害,α-干擾素(Interferon alpha,IFN-α)是目前少數(shù)臨床治療乙型肝炎有效的藥物之一,但對其抗病毒機制尚未完全明了。為闡明

3、這一作用機制,復(fù)旦大學(xué)熊偉等,應(yīng)用人cDNA微點陣芯片檢測了人肝腫瘤細胞(HepG2細胞)和來源于HepG2細胞并整合有HBV基因組的HepG2.2.15細胞經(jīng)IFN-α處理6小時前后基因表達譜的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與HepG2細胞相比,在HBV持續(xù)復(fù)制的HepG2.2.15細胞中,IFN-α誘導(dǎo)的髓樣細胞分化蛋白(MyD88)的基因表達顯著降低,提示HBV復(fù)制可能抑制MyD88基因的表達。進一步應(yīng)用核苷類似藥物拉米夫定(Lamivudin

4、e)和阿德福韋酯(Adefovir)抑制HepG2.2.15細胞中HBV復(fù)制,再用IFN-α處理細胞,發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15細胞中MyD88基因的表達顯著增加,由此確認HBV可抑制IFN-α誘導(dǎo)的MyD88基因的表達,這也提示MyD88蛋白可能在IFN-α誘導(dǎo)的抗HBV效應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。目前已知,MyD88蛋白是Toll樣受體(除了TLR3之外,其他TLRs均由MyD88蛋白介導(dǎo)信號傳遞)、白介素-1受體、白介素-18受體介導(dǎo)的信

5、號通路中的關(guān)鍵分子,由它參與構(gòu)成的信號級聯(lián)最終引起核因子kappa B(Nuclearfactor-kappa B,NF-kB)依賴性信號通路的活化。
　　 目的：
　　 熊偉等的研究也表明:在HepG2和Huh7中過表達MyD88蛋白可降低HBV的復(fù)制水平。并表明過表達MyDS8蛋白可以激活NF-kB,并且MyD88蛋白對HBV的抑制作用依賴于NF-kB的激活。但是MyD88如何激活NF-kB以及NF-kB激活之后通過

6、什么方式來抑制HBV的復(fù)制和蛋白表達,至今還不明了。本課題從MyD88蛋白下游的細胞因子的產(chǎn)生方面來探討MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制的分子機制。
　　 方法：
　　 因為這一現(xiàn)象首先在HepG2.215細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn),所以在我首先在HepG2.215細胞中確定MyD88的作用,為了解決HepG2.215細胞轉(zhuǎn)染效率低的問題,我們以連接了MyD88全場序列腺病毒為載體感染HepG2.215細胞,以無關(guān)的綠色熒光蛋白(Green

7、-Fluorescent Protien,GFP)作為對照,并用免疫熒光的方法保證了感染的效率,48小時后收細胞,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測上清中的HBsAg和HBeAg的含量,再抽提RNA逆轉(zhuǎn)錄,以實時熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測HBV RNA水平,并用Northern blotting確認結(jié)果,抽提乙肝病毒核心顆粒的DNA(HBV Core-particle DNA),用Real-time PCR檢測

8、DNA水平,并用Southern blotting確認。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與GFP相比,感染了帶有MyD88序列腺病毒的HepG2.215細胞的上清中的HBsAg和HBeAg的含量以及細胞內(nèi)RNA的含量以及Core particle DNA的含量全面下降。
　　 結(jié)果：
　　 MyD88的過表達可以激活NF-kB依賴的信號通路,而NF-kB的活化又可以啟動一序列細胞因子(包括白介素和干擾素)的轉(zhuǎn)錄,由此,我們觀察了常見的受NF-

9、kB活性調(diào)控的細胞因子是否受到MyD88的調(diào)節(jié)。由此我們轉(zhuǎn)染了MyD88之后觀察一些細胞因子的mRNA水平以及上清中分泌的細胞因子的量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)和其他細胞因子相比,IL-8的表達水平很高,由此我們推測MyD88抑制HBV的復(fù)制可能與其誘導(dǎo)IL-8的分泌相關(guān)。為確認這一結(jié)論,我們進一步測試這些分泌到上清中的細胞因子是否在發(fā)揮抗病毒作用,我們做了上清轉(zhuǎn)換試驗,即將轉(zhuǎn)染了空載和MyD88的細胞培養(yǎng)24-48h后上清轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)染了HBV的細胞上再