腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的cIAP2蛋白抑制乙型肝炎病毒復(fù)制機(jī)理的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是困擾我國人民健康的重要傳染性病原體，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球有3.5億左右的HBV感染者或者病毒攜帶者，中國有1.2億左右，這些HBV感染者有相當(dāng)一部份發(fā)展成為慢性乙型肝炎，有些還可能進(jìn)一步演變?yōu)楦斡不?、肝?xì)胞癌等。國外有報(bào)道使用重組的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)可以非殺細(xì)胞的方式抑制HBV的復(fù)制，但是具體機(jī)制仍不清楚。目前一般認(rèn)為，腫瘤壞死因子α

2、介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)實(shí)質(zhì)是病毒和宿主細(xì)胞兩方面因素共同作用的結(jié)果，腫瘤壞死因子可以通過和受體的結(jié)合，引起一系列的信號的傳導(dǎo)過程，從而上調(diào)一些抗病毒蛋白的表達(dá)。 本室劉曉穎博士應(yīng)用含有14112個靶基因的人cDNA微點(diǎn)陣，檢測了經(jīng)TNF-α處理6小時(shí)前后HeoG2細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8個基因發(fā)生上調(diào)，23個基因發(fā)生下調(diào)。應(yīng)用Real Time-PCR驗(yàn)證，證實(shí)cIAP2，B4-2,diubiquitin和MAD3等

3、基因的轉(zhuǎn)錄水平可受TNF-α調(diào)控，其中cIAP2蛋白能被顯著的上調(diào)。cIAP2蛋白是抑制凋亡蛋白(IAP)家族的一員，其C端為Ring結(jié)構(gòu)，具有泛素連接酶3的活性；其N端為三個BIR模序，它們通過不同方式可以阻止多種內(nèi)、外源性信號所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，劉曉穎博士使用cIAP2蛋白表達(dá)質(zhì)粒與HBV復(fù)制型質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，并檢測其對HBV基因復(fù)制和表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α在抑制HBV復(fù)制的同時(shí)，可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性cIAP2蛋白的表達(dá)；

4、cIAP2蛋白單獨(dú)表達(dá)即可抑制HBV蛋白的合成、基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。同時(shí)應(yīng)用siRNA干擾cIAP2蛋白的內(nèi)源性表達(dá)后再用TNF-α進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)TNF-α對HBV RNA的抑制作用被減弱，提示cIAP2蛋白在TNF-α抑制HBV復(fù)制信號通路中發(fā)揮重要作用，但尚不明確其作用機(jī)制。 本研究首先重復(fù)劉曉穎博士siRNA的結(jié)果，ELISA．檢測證實(shí)針對cIAP2蛋白的siRNA可以減弱TNF-α抑制HBV復(fù)制的作用。進(jìn)而構(gòu)建或獲得cIA

5、P2蛋白的多種突變體，包括全長cIAP2(pRK5-Flag-clAP2)，cIAP2蛋白C端Ping結(jié)構(gòu)部分缺失質(zhì)粒(pRK5-Flag-cIAP2△)，單獨(dú)表達(dá)cIAP2蛋白的N端質(zhì)粒(pRK5-Flag-cIAP2 N)以及單獨(dú)表達(dá)其C端的質(zhì)粒(pRK5-Flag-cIAP2 C)。將以上突變體和HBV復(fù)制型質(zhì)粒pHBV3.8(Adr)共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cIAP2和cIAP2 C能夠降低細(xì)胞上清中HBsAg，HB

6、eAg的水平，同時(shí)能抑制細(xì)胞內(nèi)HBV的總RNA以及復(fù)制中間體HBV DNA的的水平，而cIAP2△和cIAP2N卻不表現(xiàn)出上述的變化，結(jié)果提示cIAP2蛋白抑制HBV的復(fù)制依賴于其C端的Ring結(jié)構(gòu)的完整性。鑒于Northern Blot結(jié)果顯示cIAP2蛋白能夠抑制細(xì)胞內(nèi)HBV的總RNA水平，本研究檢測了cIAP2以及pRK5空載對于HBV四個啟動子報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒SP1，SP2，EnI/Xp，EnII/Cp活性的影響。雙熒光報(bào)道系統(tǒng)檢測結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)，與空載相比，全長的cIAP2蛋白并不能顯著的影響HBV的啟動子的活性，表明cIAP2蛋白并不是通過影響HBV的啟動子的活性來發(fā)揮抑制：HBV復(fù)制的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以調(diào)節(jié)cIAP2蛋白的表達(dá)，而cIAP2蛋白又可通過正反饋的方式再次激活NF-κB。為了檢測cIAP2蛋白抑制HBV的復(fù)制是否通過激活NF-κB信號通路，將HBV復(fù)制型質(zhì)粒Adr，cIAP2單獨(dú)以及．Adr和cIAP2一起與NF-κB報(bào)道質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染H

8、uh-7細(xì)胞，同時(shí)加入重組的人TNF-α作為陽性對照。結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨(dú)加入TNF-α或者在有HBV的情況下加入TNF-α，都可以顯著的上調(diào)NF-κB報(bào)道質(zhì)粒的活性，而cIAP2不能顯著地上調(diào)NF-κB報(bào)道質(zhì)粒的活性。以上結(jié)果表明cIAP2蛋白抑制HBV的復(fù)制并不是通過激活NF-κB信號通路來實(shí)現(xiàn)。 文獻(xiàn)報(bào)道cIAP2具有E3連接酶的活性，可以促進(jìn)一些底物蛋白，譬如casp2Lse3等的降解。德國的一個研究小組報(bào)道，另

9、一種E3連接酶Nedd4可以促進(jìn)HBV Core蛋白的泛素化。為了闡明cIAP2是否通過發(fā)揮E3連接酶的作用從而促進(jìn)HBV關(guān)鍵蛋白的降解，進(jìn)一步構(gòu)建了HBV蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，分別為pEGFP-HBV-Core，pEGFP-HBV-X，pcDNA3.1-3×Flag-HBV polymerase。將上述質(zhì)粒分別與全長的cIAP2質(zhì)粒和Ring結(jié)構(gòu)部分缺失質(zhì)粒cIAP2△一起瞬時(shí)共轉(zhuǎn)Huh-7細(xì)胞，48小時(shí)后檢測上述蛋白的表達(dá)。Western

10、 Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載和突變體相比，全長的cIAP2蛋白并不能影響HBV-Core和HBV-X的表達(dá)，但是能夠抑制HBV多聚酶蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的劑量依賴試驗(yàn)證明cIAP2能夠以劑量依賴的方式抑制HBV多聚酶蛋白的表達(dá)，而cIAP2△則沒有表現(xiàn)上述特性。在上述實(shí)驗(yàn)中加入蛋白酶體抑制劑MG132，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MG132能夠阻止cIAP2蛋白抑制HBV多聚酶蛋白表達(dá)的作用，提示cIAP2蛋白能夠促進(jìn)蛋白酶體對于HBV多聚酶蛋白的降解。

11、 綜上所述，本研究部分揭示了TNF-α誘導(dǎo)的cIAP2蛋白抑制HBV復(fù)制的機(jī)制；證明cIAP2抑制HBV的作用依賴于其C端的Ring結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)cIAP2不能抑制HBV啟動子的活性，也不能通過激活NF-kb信號通路來發(fā)揮其抑制HBV復(fù)制的作用；cIAP2能夠促進(jìn)HBV多聚酶蛋白的降解，并且這種促進(jìn)作用可以被蛋白酶體抑制劑MG132所阻斷。本研究豐富了TNF-α抑制HBV作用機(jī)制的認(rèn)識，并為研制新型抗HBV藥物提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)