VIM-2型金屬β-內(nèi)酰胺酶酶學特性研究.pdf

1、1.目的:
　　了解汕頭地區(qū)銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥情況和耐藥原因,并對銅綠假單胞菌所產(chǎn)VIM-2型獲得性金屬β-內(nèi)酰胺酶(以下簡稱VIM-2酶)的編碼基因進行序列分析,明確酶基因表型;構(gòu)建表達載體pET-41b(+)與VIM-2酶編碼基因的重組質(zhì)粒,并在大腸埃希菌BL21(DE3)中進行原核表達;將已經(jīng)成功表達的融合蛋白進行純化后測定其等電點;測定多種β-內(nèi)酰胺類抗生素對酶的穩(wěn)定性以及酶動力學參數(shù),并觀察溫度及pH等因素對酶

2、活性的影響。
　　2.方法:
　　2.1、參照文獻,設(shè)計合成 IMP、VIM和SPM-1型獲得性金屬酶以及銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD2的上下游引物,以煮裂法提取細菌總DNA作為模板,運用PCR技術(shù)篩選含獲得性金屬酶基因和OprD2基因的陽性菌株。
　　2.2、參照文獻,設(shè)計合成VIM-2酶全長基因的上下游引物,以煮裂法提取標準菌株總DNA作為模板,PCR擴增VIM-2酶編碼基因,將PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體連接后測

3、定VIM-2酶的核苷酸序列。
　　2.3、將 VIM-2酶全長基因克隆至表達載體 pET-41b(+),再轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌 BL21(DE3)中,以IPTG誘導(dǎo)其表達并純化,并用SDS-PAGE電泳檢測表達和純化情況。
　　2.4、等電聚焦電泳測定重組蛋白等電點(pI)。
　　2.5、用分光光度法測定多種β-內(nèi)酰胺類抗生素對VIM-2酶的穩(wěn)定性,并測定VIM-2酶對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素的動力學參數(shù),以及溫度、pH、底

4、物濃度和抑制劑(EDTA)等因素對酶活性的影響。
　　3.結(jié)果:
　　3.1、46株銅綠假單胞菌均沒有攜帶獲得性金屬酶基因;46株菌中有7株含有銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD2的編碼基因。
　　3.2、以標準菌株總DNA作為模板,PCR擴增出大小為801bp的片段,與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)GenBank作同源性比較,與GenBank上登錄的blaVIM-2100％符合。
　　3.3、SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,重組菌經(jīng)

5、IPTG誘導(dǎo)1~4 h并純化后,在56.4 KDa處可見特異性表達條帶,此為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和VIM-2酶的融合蛋白。
　　3.4、等電聚焦電泳測得重組蛋白等電點為5.14。
　　3.5、VIM-2酶對碳青霉烯類抗生素的水解能力最強,其次是第一代頭孢菌素和青霉素G,對第二代和第三代頭孢的水解能力相對較弱,不能水解氨曲南。EDTA能抑制VIM-2酶的活性;在pH為7.5,溫度為40℃時酶的活性最大;底物濃度在10~20