Hcy相關(guān)酶CBS及CystainC基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的關(guān)系.pdf

1、背景
　　 缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)是一組突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病,使局部腦組織短暫或持續(xù)缺血、缺氧,甚至造成腦組織軟化壞死的疾病。臨床表現(xiàn)為局灶性神經(jīng)功能缺失,或伴發(fā)意識(shí)障礙。它主要包括:1.短暫性腦缺血發(fā)作2.動(dòng)脈血栓性腦梗塞3.栓塞性腦梗塞4.腔隙性腦梗塞四種類型。目前比較明確的病因主要有:血管壁病變(高血壓性動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化),心臟病和血流

2、動(dòng)力學(xué)改變,血液成分和血液流變學(xué)改變,及各種類型的栓子,腦血管受壓、外傷、痙攣等,而具有高血壓病,糖尿病,心臟病,高脂血癥及吸煙等卒中危險(xiǎn)因素的患者更容易罹患缺血性腦血管病。
　　 近年來(lái)ICVD的病因及發(fā)病機(jī)制研究已取得很大進(jìn)展,高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)也逐漸被認(rèn)為是ICVD的又一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而引起Hcy水平升高的主要因素是其代謝相關(guān)酶的輔酶維生素的缺乏,其中胱硫醚-β合成酶

3、(cystanthionine-β synthetase,CBS)(844ins68和G919A基因位點(diǎn))、N5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)(C677T和A1298C基因位點(diǎn))、蛋氨酸合成酶還原酶(Methionine synthasereductase,MTRR)(A66G基因位點(diǎn))、蛋氨酸合成酶(Methionine synthase,MS)(D9

4、19G基因位點(diǎn))等代謝酶的研究較多,且發(fā)現(xiàn)這些酶的突變位點(diǎn)基因多態(tài)性與ICVD的發(fā)生存在某種關(guān)聯(lián),可能成為ICVD的發(fā)病機(jī)制之一。但是CBS第27796位T-C基因突變位點(diǎn)(CBST27796C)是否也可能導(dǎo)致血漿Hcy水平改變,其多態(tài)性與ICVD是否存在關(guān)聯(lián)性,目前類似的研究仍然相對(duì)較少。
　　 近年來(lái)有關(guān)半胱氨酸蛋白酶抑制因子(Cystatin C,Cys C)與ICVD的關(guān)系也越來(lái)越受到人們的重視,Olsson T等在對(duì)C

5、ys C基因敲除小鼠模型進(jìn)行研究時(shí),發(fā)現(xiàn)Cys C基因敲除的小鼠發(fā)生腦梗死的數(shù)量較多,可能是Cys C對(duì)蛋白酶抑制劑的作用減弱了,即Cys C可能是腦梗死的一種保護(hù)因子。但目前多數(shù)研究者認(rèn)為Cys C可能是ICVD發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一?？偹苤?動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)這一慢性炎癥過(guò)程是ICVD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素,而有研究發(fā)現(xiàn)Cys C的缺失可能是AS的發(fā)病機(jī)制之一,從而從而間接促進(jìn)ICVD的發(fā)生。也有研究認(rèn)為

6、Cys C可引起血管壁淀粉樣病變的蛋白沉積,考慮Cys C可能與腦梗死發(fā)病有關(guān)。國(guó)外研究也指出Cys C水平升高與缺血性和出血性腦卒中的發(fā)生具有直接相關(guān)性,Cys C是腦血管事件和死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因子。目前有關(guān)Cys C基因Rs2897119(-177C/T)多態(tài)性與ICVD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間是否也存在某種關(guān)系,目前國(guó)內(nèi)此類研究仍然較少。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)病例-對(duì)照研究,用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(polymera

7、se chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)對(duì)此兩個(gè)基因位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行多態(tài)性分析,以進(jìn)一步探討CBST27796C及Cys C Rs2897119(-177C/T)基因位點(diǎn)與ICVD的關(guān)系。
　　 目的
　　 研究胱硫醚-β合成酶(CBS)基因T27796C與半胱氨酸蛋白酶抑制因子CysC Rs2897119(-177C/T)

8、基因多態(tài)性及其與ICVD的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1.研究對(duì)象:病例組入選人數(shù)有185人,男性122例,女性63例,年齡36～86歲,平均61.39歲,所有患者均符合1995年第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的急性缺血性腦血管病的診斷標(biāo)準(zhǔn),其中腦梗塞患者均經(jīng)頭顱CT和(或)MRI檢查確診,包括短暫性腦缺血發(fā)作,動(dòng)脈血栓性腦梗塞,栓塞性腦梗塞,腔隙性腦梗塞患者。對(duì)照組入選人數(shù)有111人,男性71例,女性40例,年齡32

9、～87歲,平均59.05歲,所有入選人員均為無(wú)缺血性腦血管病史,無(wú)臨床血管事件發(fā)生的神經(jīng)內(nèi)科其他住院病人及健康體檢者。兩組中均排除腦出血,蛛網(wǎng)膜下腔出血等出血性腦血管病患者,無(wú)帕金森病、癡呆史,無(wú)甲狀腺疾病,無(wú)肝臟及腎臟疾病等,無(wú)服用葉酸、維生素B12、美多芭等藥物史。
　　 2.所有入選研究對(duì)象均取早晨空腹肘靜脈血3ml,并予2％EDTA-2Na一次性試管中,混勻抗凝,置入-40℃冰箱內(nèi)保存,準(zhǔn)備提取全血基因組DNA。

10、　　 3.采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法進(jìn)行CBST27796C及Cys C Rs2897119基因目的基因片段擴(kuò)增,擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果參照Marker標(biāo)準(zhǔn)判斷。
　　 4.將PCR產(chǎn)物應(yīng)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)分析方法進(jìn)行分析,HpaⅡ及SmaⅠ進(jìn)行酶切,電泳讀取檢測(cè)結(jié)果

11、,進(jìn)行CBS T27796C及Cys C Rs2897119(-177C/T)基因多態(tài)性分析和等位基因分型。
　　 5.應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。病例組和對(duì)照組基因型分布經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),有群體代表性。CBS T27796C及Cys CRs2897119(-177C/T)基因型、等位基因數(shù)用直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù),并計(jì)算各等位基因頻率,組間比較采用x2檢驗(yàn),取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

12、　　 結(jié)果：
　　 1.病例組和對(duì)照組中血漿總同型半胱氨酸(total homocysteine,tHcy)水平具有顯著性差異(t=6.532,P<0.05),顯示病例組血漿tHcy水平明顯高于對(duì)照組。
　　 2.病例組和對(duì)照組CBS T27796C基因型及等位基因頻率分布均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.ICVD的不同類型中CBS T27796C基因型頻率及等位基因頻率分布不具有顯著性差異(P>0

13、.05)。
　　 4.病例組和對(duì)照組Cys C Rs2897119(-177C/T)基因型頻率及等位基因頻率分布不具有顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在高同型半胱氨酸血癥人群中,ICVD的發(fā)生率相應(yīng)較高,血漿總同型半胱氨酸升高是ICVD發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。
　　 2.Hcy代謝相關(guān)酶CBS基因突變T27796C及半胱氨酸蛋白酶抑制因子CysC Rs2897119(-177C/T)