外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)HBcAg含量與乙型肝炎病毒載量相關(guān)性的研究.pdf

1、目的：
　　1.利用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy,CLSM）檢測(cè)慢性乙型肝炎病毒感染者的血清、外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral bloodmononuclear cells；PBMC）內(nèi)HBcAg含量。
　　2.探討慢性乙型肝炎病毒感染者PBMC中HBcAg表達(dá)、分布的變化情況；及其與血清中HBV載量關(guān)系。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象
　　本

2、實(shí)驗(yàn)從2015年9月至2016年7月之間，北京大學(xué)深圳醫(yī)院感染性疾病科科門診、住院患者中篩選病例，納入研究的患者 HBsAg陽性持續(xù)時(shí)間超過6個(gè)月，即為慢性乙型肝炎患者（Chronic hepatitis B，CHB），未接受抗病毒治療，且無HBV感染相關(guān)并發(fā)癥。最終篩選出25名未接受任何抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者，留取血液樣本作為試驗(yàn)組一。篩選出12名符合上述條件的患者，對(duì)其用PEG-干擾素α-2a治療一年，每周180ug，且最終血

3、清中HBV DNA陰性，此研究對(duì)象作為試驗(yàn)組二。同時(shí)選取3名正常人作為對(duì)照組，其血清中HBsAg、HBV DNA及HBcAg均為陰性，且HBsAb陽性。所有納入的研究對(duì)象（患者，正常對(duì)照者）的血清丙型肝炎病毒抗體、丁型肝炎病毒抗體以及HIV均為陰性。本研究通過北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理機(jī)構(gòu)審核。所有納入對(duì)象都簽署知情同意書。
　　2.實(shí)驗(yàn)室檢查
　　用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)各組研究對(duì)象血清中、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中HB

4、sAg、HBcAg等乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物。用Cobas TaqMan（檢測(cè)水平在IU/ml）檢測(cè)血漿中和PBMC中的HBV DNA水平。利用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy；CLSM）檢測(cè)所有樣本 PBMC的細(xì)胞核、細(xì)胞漿內(nèi) HBcAg含量。應(yīng)用AU5400生化分析儀檢測(cè)各組研究對(duì)象血清中ALT水平。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　所有數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資

5、料用中位數(shù)描述，統(tǒng)計(jì)分析包括Mann-Whitney U檢驗(yàn)，Spearman線性相關(guān)分析等，取P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1實(shí)驗(yàn)組一（慢性乙型肝炎患者組）血清中和PBMC內(nèi)的HBV DNA水平及相關(guān)性分析結(jié)果
　　20名患者（case1-20）血清中HBV DNA陽性，5名患者（case21-25）陰性。HBeAg陰性患者中有8名患者PBMC內(nèi)HBV DNA陰性。在PBMC HBV DNA陽性患

6、者中，血清中和 PBMC內(nèi) HBV DNA水平中位數(shù)分別為（3.26×106IU/ml，3.38×103IU/ml）。HBeAg陽性患者血清中HBV DNA水平明顯高于HBeAg陰性患者（4.61×107 IU/ml VS3.88×104IU/ml；P＜0.001）。同時(shí)前者PBMC內(nèi)HBV DNA水平也明顯高于后者（2.10×104IU/ml VS1.13×103IU/ml；P＜0.001）。血清中和PBMC內(nèi)HBV DNA的Spea

7、rman相關(guān)系數(shù)為0.88。HBeAg陽性患者中，血清中與PBMC內(nèi)的HBV DNA載量有明顯的相關(guān)（r=0.78；P＜0.05）。HBeAg陰性患者中，兩者也有明顯相關(guān)關(guān)系（r=0.74；P＜0.05）。
　　2.實(shí)驗(yàn)組二中（干擾素治療組）PBMC內(nèi)的HBV DNA水平
　　本實(shí)驗(yàn)組中所有樣本的血清中都未檢測(cè)出HBV DNA，但是有7例患者（58.3％） PBMC內(nèi)HBV DNA陽性。其中5例（71.4%）PBMC HBV

8、 DNA陽性樣本為HBeAg陽性患者。2例（28.6%）樣本為HBeAg陰性患者。HBsAg陰性樣本中，血清中和PBMC內(nèi)均未檢測(cè)出HBV DNA。
　　3. CLSM檢測(cè)HBcAg陽性的PBMC中，HBcAg陽性信號(hào)顯示在細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核上，對(duì)照組無HBcAg陽性信號(hào)。
　　4. HBcAg陽性PBMC的百分比與HBV DNA之間關(guān)系
　　在HBV DNA陽性的PBMC樣本中，HBcAg陽性的PBMC百分比為0.2

9、%-39%。HBV DNA陰性樣本和對(duì)照組中的PBMC內(nèi)未檢測(cè)出HBcAg。HBcAg陽性PBMC的百分比與PBMC內(nèi)HBV DNA水平高度相關(guān)。Spearman相關(guān)系數(shù)為0.833（P＜0.001）。在血清和PBMC內(nèi)HBV DNA均為陽性的患者中，HBcAg陽性PBMC的百分比與血清中HBV DNA載量高度相關(guān)（r=0.833.P＜0.001）。
　　5.亞組分析HBV感染的PBMC中，細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)HBcAg陽性的PBMC

10、百分比
　　細(xì)胞核內(nèi)HBcAg陽性的PBMC的數(shù)量在非活動(dòng)性病例中更高。組二中，PBMC細(xì)胞漿內(nèi)HBcAg百分比明顯高于細(xì)胞核內(nèi)的HBcAg百分比（P＜0.05）。疫耐受患者的PBMC細(xì)胞核內(nèi)的HBcAg百分比明顯高于其細(xì)胞漿內(nèi) HBcAg的百分比（P＜0.001），而在免疫清除患者中，PBMC細(xì)胞漿內(nèi)的HBcAg百分比明顯高于其細(xì)胞核內(nèi)HBcAg的百分比（P＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.慢性乙型肝炎患者PBM